神经生长因子和增殖细胞核抗原在人脑胶质瘤中的表达及意义探究.docVIP

神经生长因子和增殖细胞核抗原在人脑胶质瘤中的表达及意义探究 　　胶质瘤的发生、发展与细胞增殖、分化、迁移、凋亡及血管生成的信号通路异常有关。神经生长因子(nerve　growth　factor，NGF)主要来源于中枢神经系统，可以诱导神经纤维生长，并影响瘤细胞的增生、分化及凋亡。增殖细胞核抗原(proliferation　cell　nuclearantigen，PCNA)是一种反映细胞增殖的可靠指标。本实验采用免疫组化技术，对胶质瘤中NGF及PCNA的表达进行研究，探讨它们与胶质瘤病理分级的关系及其在评估胶质瘤患者预后中的作用。 　　1　材料与方法 　　1.1　资料　武汉大学人民医院神经外科2010年7月至2012年4月收治的64例脑胶质瘤患者，男性36例，女性28例;年龄21-60岁，平均42岁。所有患者手术前均未接受放疗或化疗，术中留取的肿瘤组织标本送病理科，经两名病理科医师检查确诊。根据2000年WHO病理学分级标准，Ⅰ级14例，Ⅱ级16例，Ⅲ级18例，Ⅳ级16例。定义Ⅰ-Ⅱ级为低级别胶质瘤组，共计30例;Ⅲ-Ⅳ级为高级别胶质瘤组，共计34例。64例患者中，随访生存时间gt;2年者29例，le;2年者35例。作为对照的10例正常脑组织标本来自因颅脑损伤行开颅内减压术的患者，其固定、包埋、切片程序同胶质瘤标本。 　　1.2　试剂　兔抗人NGF多克隆抗体(稀释度1∶150)，PCNA单克隆抗体(稀释度1∶150)及Ultra-Sensitive　SP试剂盒、多聚-L-赖氨酸溶液、DAB显色试剂盒等购于武汉博士德生物制品公司。磷酸盐缓冲液(phosphonate　buffer　solution，PBS)购于福州迈新生物技术开发公司。抗原采用微波炉加热进行修复。 　　1.3　免疫组化染色方法　所有肿瘤及正常脑组织标本均经甲醛固定，并石蜡包埋切片(4mu;m)，免疫组化染色严格按照试剂盒操作说明进行，采用微波修复抗原。阴性对照标本仅以PBS液替代一抗，余操作相同。 　　1.4　结果判定　为避免观察测量偏倚，对参与阅片的病理科医师采取盲法原则，且由两名病理科医师分别进行阅片并确诊。NGF阳性染色表现为细胞核及细胞质被染成棕黄色;PCNA 阳性染色则主要表现为胞核被染成黄色或棕黄色。随机选择5-10个高倍视野进行细胞计数，阳性表达率按阳性染色的细胞数占细胞总数的百分比判断。将阳性表达率10%-25%定义为(+);25%-50%定义为(-);gt;50%定义为(+);将标本阳性细胞百分率lt;10%定义为(-)。 　　1.5　统计学处理　应用SPSS　20.0统计软件进行实验数据的统计学处理，采用chi;2检验进行两组间阳性表达率的比较;采用Spearman等级相关分析计算两因数之间的相关性，Plt;0.05认为差异有统计学意义。 　　2　结果 　　2.1　NGF及PCNA在正常脑组织及胶质瘤内的表达　胶质瘤细胞内NGF和PCNA的阳性表达率明显高于正常脑组织(Plt;0.05)，两者在高级别胶质瘤组与低级别胶质瘤组间的阳性细胞表达率也有显著差异(Plt;0.05)，在生存时间le;2年组中，NGF及PCNA阳性表达率均高于生存时间gt;2年组，差异有统计学意义(Plt;0.05)。 　　2.2　NGF 与PCNA 的相关性分析　本研究经Spearman等级相关检验分析显示，NGF与PCNA在人脑胶质瘤中的表达呈正相关(Plt;0.05，rs=1.000)。 　　3　讨论 　　NGF及其受体广泛分布于中枢神经系统，并存在于大多数神经元及胶质细胞中，维持神经系统的正常发育和功能，同时对神经细胞的生长与分化具有重要的调节作用。目前，NGF与肿瘤生长的关系日益受到关注，研究已证实NGF参与了非中枢神经系统肿瘤的发生、发展和转移的过程。关于NGF对人脑胶质瘤的作用，亦有相关研究。张志坚等在体外人脑胶质瘤细胞株U251细胞的实验研究中发现，U251细胞能够高表达NGF并将其分泌至细胞外，同时，U251细胞对其高亲和力受体-酪氨酸蛋白激酶受体A(TrkA)亦有高表达。细胞在分裂相贴壁生长6h后，后者主要定位于细胞膜，此时细胞外NGF与细胞膜上TrkA 结合后形成复合物内化入并进入细胞内;在细胞培养12h以及G1/S期时，两者共同位于细胞核内，通过多靶点作用模式对U251细胞的生物学行为进行调控。另外，NGF还能够通过TrkA介导的信号转导机制，抑制机体产生与分泌肿瘤相关的免疫球蛋白，从而有助于肿瘤细胞的免疫逃避。而更早的研究发现，胶质瘤细胞株U251、U87和U373细胞可在外源性NGF的作用下增殖，其增殖效应呈现NGF的剂量依赖性。