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啤酒酵母的高密度发酵 生物与食品工程学院 Xxxxxx xxxxxxxxx 组员 高细胞密度发酵（high cell density fermentation,HCDF） 高细胞密度发酵是一个相对的概念，一般指发酵液中细胞浓度在30g/L以上。但是对于一些极端微生物或自养微生物，细胞浓度如果达到1g/L也算比较高的细胞密度。 影响因素：培养基、接种量、生长抑制性物质、溶解氧浓度、温度、pH等 过程控制途径：培养基设计、反应器的设计和选择、发酵控制策略等 酵母的高密度发酵是一个相对的概念，一般指发酵液中的酵母细胞浓度在100g/L以上。 酵母属大约包括40种，每个种都能通过出芽产生球状或椭圆状的细胞。 酵母菌是一种兼性厌氧菌，当酵母在低浓度的葡萄糖中进行好氧生长时，它能把葡萄糖分解成二氧化碳和水。当酵母在厌氧条件下生长时，葡萄糖主要生成乙醇和二氧化碳。 酵母菌的高细胞密度发酵 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 是发酵工业最常用的菌种之一 在发酵中如果单方面提高发酵液中的碳源含量，酵母菌就会生成乙醇或乙酸，但其生物量则有所下降；如果将碳源保持在最低水平，就会限制酵母的生长。而利用分批补料发酵的方式，既可以满足高密度 发酵时酵母细胞对营养源的大量需求，又能减少生长抑制物质的产生。 影响酵母高细胞密度发酵的因素 培养基的营养物质 溶解氧（DO） 压力 CO2 温度 pH值 发酵液的流变学 接种量 生长抑制性物质 培养基的营养物质的影响 培养基中的基质的种类和浓度直接影响到细胞的代谢变化和产物的合成。在发酵前期，碳源和氮源的浓度迅速下降，在中后期主要用于合成产物，其浓度下降趋于平稳。碳源和氮源的比例偏小，会导致细胞生长旺盛，提前衰老自溶；而其比例偏大，则细胞繁殖数量少，代谢不平衡，不利于产物积累。 所需营养物质：水分、碳源物质、氮源物质、无机元素、生长因子 在高细胞密度发酵过程中，如果葡萄糖浓度超过其一阈值，碳源供给量高于酵母所能同化的速率，即使是在供氧充足的条件下也会发生克拉布特里（Crabtree）效应而产生乙醇，而糖的有氧氧化受到抑制，这是对发酵不利的。所以要对营养物的配比进行优化 解决途径：在实际发酵中，基质浓度和碳源氮源比例主要依靠流加补料来实现和维持。（碳氮比、流加量、流加频率） 种子培养基：蔗糖25g/L，尿素3g/L，KH2PO4 10g/L,MgSO4 2.5g/L,微量元素10 ml/L，维生素液15ml/L，pH 5.0（供发酵前菌体大量生长繁殖） 发酵培养基：（NH4）2SO4 15g/L，KH2PO4 8.0g/L，MgSO4 3.0g/L,微量元素液 10 ml/L，消泡剂 0.3ml/L，ZnSO4 0.4g/L. 流加培养基：KH2PO4 9.0g/L,MgSO4 2.5g/L,K2SO4 3.5g/L,NaSO4 0.28g/L,蔗糖500g/L（流加补料，用于维持高比生长速率或者高产物生产速率） 我们用的培养基类型 微量元素配方和维生素配方 微量元素:在1L溶液中含有EDTA15g，znso45.75g,Mncl20.32g,Cuso40.50g,Cocl20.47g,Na2MoO40.48g,Cacl22.9g,Feso42.8g,121℃湿热灭菌20min待用。 维生素：在1L溶液中含有维生素H0.05g，泛酸钙1.0g，烟酸1.0g，肌醇25.0g,对氨基苯甲酸0.2g，硫胺素1.0g，吡哆醇1.0g。 碳源与氮源分开灭菌，防止“美拉德反应”产生有毒物质抑制菌体生长； 蔗糖要单独灭菌后加入，尿素和维生素液通过微孔滤膜过滤除菌后加入； 为防止焦糖化反应，将碳水化合物pH调至低于4.0灭菌 培养基配制注意事项 溶解氧（DO）的影响 DO是发酵工程中的一个关键限制因素，是高细胞密度发酵过程中影响酵母生长的重要因素之一。在高密度发酵的后期由于细胞密度的扩增，耗氧量极大，发酵罐的各项物理参数不能满足对氧的供给，造成DO下降，细胞生长减慢。 溶解氧（DO）范围：40%DO60%. 1.提高机械搅拌速率 适当提高搅拌转速，增加气液接触面积，有利于氧的传递，但搅拌速率过大会使发酵泡沫过多，反而会导致DO降低。 2. 增大空气流量 空气流量的增大减小了氧传质工程中的气膜阻力，有利于氧的传递吸收。但过大的流量会形成“过载”现象，使大量发酵液蒸发，引起浓缩和粘度上升。 增加发酵液中DO的方法 压力的影响 在发酵工程中必须保持罐压为正压，如果罐压为0或者负压，则会造成细胞的染菌，甚至造成整罐发酵液的废气。罐压增高能适度增加氧在发酵液中的溶解度，但二氧化碳在水中的溶解度要比氧大30倍，溶解过多的二氧化碳会造成细胞染菌，所以罐压也不能太高。 我们选取的罐压为0.05Mpa. CO2的影响 酵母