不同样品核酸提取、扩增、荧光定量PCR完美解决方案.ppt

ABI比较 Bio-rad test * Bio-rad melting curve * MSN:grasepp@ QQ:* * * * 所谓实时荧光定量PCR,就是实时监测PCR过程中每一个循环的产物的荧光信号，得到一个荧光变化曲线，以此来实现对初始模板的定量分析。对于这个定义，大家可能会问两个问题，第一个就是在PCR过程中这个荧光信号是怎样产生的；第二个就是得到荧光曲线后如何实现对初始模板的定量。关于第一个问题，我留在后面讲，但大家要记住一点，这个荧光信号与产物量是成正比的。 我先解释第二个问题。 * 统计分析方法 绝对定量： 此方法是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA。 ? 相对定量： 通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因表达差异,一般是 2-??Ct 。或者是考虑扩增效率的Pfaffl法。 绝对定量 相对定量 Marisa L. Wong and Juan F. Medrano: BioTechniques July 2005 相对定量 实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测 敏感性高 需要样品少 特异性高（Taqman） 精确定量 Real-time qRT-PCR优点 RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及应用 Real-time qPCR成功关键 Real-time qPCR数据分析 Real-time qPCR常见问题及解决方案 特异性 重复性 灵敏度 其他问题 常见问题讨论 扩增的特异性 引物？ Tm，重新设计引物，优化条件 Tm 重复性判断实验优劣的重要指标 判断指标：主要为标准差（SD）和变异系数（CV） 影响重复性的因素： PCR 反应扩增的效率：优化实验条件，使反应体系达到最佳扩增效率 。 目的基因的初始浓度： 使用初始浓度具有较高数量级的样本或作平行孔。 标准曲线的影响：不少于5个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围；理想的标准品应与样本具有高同源性，质粒DNA 或是体外合成、转录的RNA。 影响灵敏度的因素 反应体系中形成的引物二聚体的影响 可以用水解探针代替SYBR Green I，有文献报导使用水解探针的敏感性要比SYBR Green I高出10倍。 可以使用热启动办法或使用特殊处理的Taq酶 要尽可能地优化引物设计 如果反应体系中出现PCR的抑制因素，应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增。 注意避免室温混合各种试剂，并且在一经混合后立即开始进行扩增。 循环数 Mg2＋的浓度 Q1:无Ct值（信号）出现 可能性不大 检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。 引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。 模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。 模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。 Q2:Ct值出现过晚（Ct＞38） 扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。 PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。 PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。 Q3:标准曲线的线性关系不佳 加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。 标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。 引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针 模板中存在抑制物，或模板浓度过高。 Q4:阴性对照也出现明显的起飞 反应mix或水被污染。 引物二聚体的出现： 用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。 反应过程中探针的降解：用PAGE电泳对探针进行检测。 ROX校正的问题：如果使用了，则可能是ROX的降解所造成。 Q5:熔解曲线不止一个主峰 引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。 镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。 模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。 Q6:扩增效率低 反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。 反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。 反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。 Q7:同样的试剂在不同仪器上产生不同的曲 线，如何比较？ 判断标准：扩增