微生物限度检查方案.doc

五、验证程序 1. 微生物限度检查方法操作环境要求 在质量控制部无菌实验系统洁净区进行，环境洁净度为10000级背景中的局部洁净度100级的单向流空气区域，实验前按《医药工业洁净室（区）悬浮离子、浮游菌和沉降菌的测试方法》进行过环境洁净度的验证，结果为合格。 2.计数培养基的适用性检查 2.1 使用以下菌种(菌株的传代次数不超过5代)来制备菌悬液。 金黄色葡萄球菌[StaphyLococcus aureus CMCC（B）26 003] 大肠埃希菌[Escherichia aureus CMCC（B）44 102] 枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis CMCC（B）63 501] 白色念珠菌[Candid albicans CMCC（F）98 001] 黑曲霉[Aspergillus niger CMCC（F）98 003] 2.2菌液的的制备 2.2.1金黄色葡萄球菌：接种金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，30～35℃培养18～24小时，取培养物1ml，加入0.9%无菌氯化钠溶液9 ml中，再用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5，制成每1ml含菌数约为50～100cfu的菌悬液。 2.2.2大肠埃希菌：接种大肠埃希菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，30～35℃培养18～24小时，取培养物1ml，加入0.9%无菌氯化钠溶液9 ml中，再用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5，制成每1ml含菌数约为50～100cfu的菌悬液。 2.2.3枯草芽孢杆菌：接种枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，30～35℃培养18～24小时，取培养物1ml，加入0.9%无菌氯化钠溶液9 ml中，再用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5，制成每1ml含菌数约为50～100cfu的菌悬液。 2.2.4白色念珠菌：接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，23～28℃培养24～48小时，取培养物1ml，加入0.9%无菌氯化钠溶液9 ml中，再用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5，制成每1ml含菌数约为50～100cfu的菌悬液。 2.2.5黑曲霉：接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天, 加入3ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱,吸出孢子悬液至无菌试管中, 取培养物1ml，加入含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9 ml中，再用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-4，制成每1ml含菌数约为50～100cfu的菌悬液。 2.2.6以上菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可以在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。 2.3 菌液计数 2.3.1 分别取上面制备的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌菌悬液各1ml 加入培养皿，注入45℃营养琼脂培养基约18 ml，每种菌悬液各制备2个平皿，置30～35℃培养48小时，取两个平皿菌落数的平均值为菌计数结果。 2.3.2分别取上面制备的白色念珠菌菌悬液1ml 、黑曲霉孢子菌悬液1ml，分别加入培养皿，注入45℃改良马丁琼脂培养基约18 ml，每种菌悬液各制备2个平皿，置23～28℃培养72小时，取两个平皿菌落数的平均值为菌计数结果。 2.4培养基适用性检查 2.4.1取50～100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌菌悬液，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂对照培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，取两个平皿菌落数的平均值为菌计数结果。 2.4.2取50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉菌悬液，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，取两个平皿菌落数的平均值为菌计数结果。 2.4.3 同时取以上相应的对照培养基同2.4.1、2.4.2操作。 2.2.5结果判断 被检培养基上的菌落数不小于对照培养基上的菌落数的70%，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。 3.稀释液、冲洗液及其制备方法 3.1 0.9%氯化钠溶液的的制备 取氯化钠9g，加水1000ml溶解，分装，灭菌。 3.2 采用验证合格的灭菌程序灭菌，即121℃高压蒸汽灭菌30分钟。 4. 供试品的取样 4.1 供试品为该品种在符合GMP要求的车间正常生产的产品,生产过程符合GMP 要求。 4.2 随机抽取具代表性的样品，作为供试品。 5.微生物限度计