活细胞高速激光共聚焦原理及应用-2014-1-8技术分析.pptx

活细胞高速激光共聚焦显微镜简介 生物技术研究室 颜次慧 2014-1-8 一. 活细胞观察的优势 活细胞动态观察 静态成像 科研角度 能够连续观察细胞及分子水平的动态变化，阐明机制，更能说明问题 需要大量样品、时间点，样品的差异化问题，出现假阳性结果 应用范围 既能满足高分辨，又能够满足时间分辨要求比较高的实验 无法做时间分辨比较高的实验，以及对细胞或分子实时动态三维观察 实验过程 实验简单化，操作步骤少，数据信息充足 实验设计复杂，步骤多，数据信息少 活细胞/活体荧光成像 目标：在最大程度保证生物活性的前提下获得真实的连续动态影像 要求：尽可能减少外界因素对生理功能的影响，把光毒性和光漂白减少到最低，尽可能降低激发光强度，所以荧光信号非常微弱 高速活细胞转盘式激光共聚焦显微镜 活细胞工作站 二、活细胞观察的革命性技术 共聚焦原理 点扫描激光共聚焦 双转盘式扫描激光共聚焦 高速活细胞激光共聚焦系统构成 共聚焦扫描单元 单光子探测器 Z轴防漂移 显微镜用活细胞CO2培养室 高精度XY电动平台 激光光源、激光耦合系统 高速压电陶瓷Z轴马达 研究及倒置荧光显微镜 系统软件 高速活细胞激光共聚焦系统用途 主要用于长时间观察并记录荧光标记的活细胞和固定细胞/组织的共聚焦图像，进而分析细胞内或细胞间发生的信号传导、蛋白表达、囊泡运动、细胞动力学、细胞与粒子之间的相互作用及生理学行为。 单光子探测器 Andor iXon 探测极微弱信号，显著减少活细胞光漂白以及光毒性损伤 1. 减少光毒性和光漂白 高速活细胞激光共聚焦系统特点 CCD芯片接收光信号并将其转换为电信号，这一过程系统会产生一定的电子噪声 电子信号经芯片上的增益寄存器可放大至1000倍 Electron Multiplying CCD (EMCCD) 2. 先进的片上增益技术 CCD EMCCD 3. 多维共聚焦成像 3D: XYT 、 XYZ 4D: XYZT 、XYZ ? 5D: XYZ ?T 6D: XYZ ?TP 4. 多视野观察 Single Image Field ~ 20 Cells 2x2 Montage ~ 80 Cells 3x3 Montage ~ 180 cells 增加了实验数据的样本量 XY电动平台 探测单元 ZDC 5. Z轴防漂移 Z轴零漂移系统 785nm Laser for auto Focus 6. 保持细胞良好生长 CO2 温度 顶部加热 载物台加热 物镜加热