培养基验证技术分析.docxVIP

1. 稀释液的制作 磷酸盐缓冲稀释液贮存液：　　　　　　　　　　　　　　　　磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0g　　蒸馏水 500mL　　用大约175 mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2（图1-1、1-2），用蒸馏水稀释至 1000 mL后贮存于冰箱。 稀释液：用蒸馏水稀释1.25mL贮存液至1000mL,分装于合适容器,121℃高压灭菌15min。 1-1 1-2 2. 培养基制作 ① 计算出所需数量，用电子称、称量纸、药勺来称取。 ② 放入比所用蒸馏水大的烧瓶中，使之充分混匀于蒸馏水后加热溶解并煮沸。 ※ 备注：即使是同一培养基，各个厂家的配制方法多少有些不同，所以一定要充分参照培养基上的说明。 2.1 倾注培养培养基： 加温溶解 （高压灭菌 ） 保 存 使用时溶解 倾 注 ● 平板计数琼脂等：高压灭菌后保存，使用时加温溶解。 ● 去氧胆酸盐琼脂培养基：使用时将培养基粉末加温溶解。 ※ 备注：倾注培养时，向培养基分注的步骤参照下述的注意事项 ① 样液稀释以及从接种到培养基混合完毕，最好在15分钟以内完成。 ② 每个平皿的分注量约15-20ml。分注后将平皿倾斜和旋转使之充分混合，但要注意不要让培养基从平皿内溢出，且不要粘附在平皿壁和盖上。 ③ 分注时三角烧瓶挂有培养基滴时，下一次分注的培养基可能被烧瓶外壁的细菌污染，所以要用酒精棉擦拭，再将瓶口用火焰灭菌。 2.2 平板培养基： 平板培养基是将溶解后的培养基分注15-20ml到无菌平皿里，使之凝固。 加温溶解 （高压灭菌） 分 注 平板培养基 干 燥 ● TCBS琼脂培养基、DHL琼脂培养基：加温溶解后，分注、凝固、干燥表面。为了防止沉淀的发生，加温溶解后要充分混匀（注意不要起泡）。 ● EMB琼脂培养基：高压灭菌后，分注、凝固、干燥表面。 ● 卵黄甘露醇高盐琼脂培养基：将鸡蛋放在95%酒精中浸泡1小时左右，用酒精棉（纱布）擦拭蛋壳表面，打开鸡蛋取出卵黄。加入经高压灭菌后冷却到55-60℃培养基里（6%卵黄）搅拌摇匀凝固后干燥表面（搅拌时不要起泡）。若培养基温度过高，卵黄凝固，过低则培养基分注时开始结块，所以操作要迅速。 ※ 备注：分注后将平皿盖打开置于无菌工作台/恒温培养箱内使培养基表面干燥。 干燥时间基准如下： 无菌超净台： 15 分钟 37℃恒温箱内倒置：20-30 分钟 2.3 斜面/高层斜面培养基： 加温溶解 分 注（试管） 高压灭菌 斜面/高层斜面培养基 加温溶解后的培养基分注到小试管3-4ml，中试管8-10ml。高压灭菌后将试管冷却至50℃左右（以防斜面上冷凝水太多），将试管口端搁在合适高度的器具上，搁置斜面长度以不超过试管总长一半为宜。高层斜面培养基制成斜面高1/3，高层为2/3。 ● 营养琼脂培养基：加温溶解后分注到中试管，高压灭菌后制成斜面。 ● TSI琼脂培养基：加温溶解后分注到小试管，高压灭菌后制成高层斜面。 2.4 液体培养基 加温溶解 分 注（试管） （高压灭菌） 液体培养基 加温溶解后的培养基和高层/斜面培养基一样，分注。一般液体培养基因过度加热易引起培养基变质,所以加热（加温溶解、高压灭菌）后用流动水等急速冷却。 ● EC、BGLB培养基：加温溶解后分注到放有倒立的发酵管的试管后高压灭菌，灭菌后用流动水急速冷却。 ● EEM培养基：加温溶解后于三角瓶在100℃灭菌30分钟。 ※ 备注： 每批培养基制备后，应仔细检查一遍，如发现破裂、水分浸入、色泽异常、瓶塞被培养基污染等，均应挑出弃去。培养基应存放于冷暗处，最好放于冰箱内。放置时间不宜超过一周，倾注的平皿培养基不宜超过3天。每批培养基均必须附有明显的标识。 3. 基本操作： 3.1 灭菌方法： ① 酒精杀菌：用75%的酒精及酒精棉，用于手指、实验台、工器具、样品外包装等的杀菌。 ② 火焰灭菌：检查中常用酒精灯/煤气灯，将烧瓶、试管、吸管、剪刀、镊子瓶口部或前端，还有接种针、接种环接种前后通过火焰。 ③ 高压灭菌：主要是吸管、培养基、稀释水以及检查完毕后的培养基等无菌。 ④ 煮沸灭菌：在沸水中加热15-30min的方法。用于镊子、剪刀、吸球等的工具灭菌。 3.2 分离转种培养 3.2.1 平皿划线： 3.2.1.1分段划线：用于含菌量较多的样品。 右手持接种环柄，将接种环垂直放在火