第三讲基因诊断与基因治疗技术分析.ppt

* * 逆转录病毒结构: 基因组组成： （1）5’－帽子；3’－尾巴； （2） 每个单链RNA含6个区： 5’-LTR（长末端重复序列） Ψ+ （组装所需的非编码序列） gag（编码衣壳结构蛋白基因） pol（编码反转录酶基因） env（编码外壳蛋白基因） 3’-LTR * * 逆转录病毒生活周期: 1、感染靶细胞 2、利用自身编码的逆反转录酶，以RNA为模板合成DNA。 3、将病毒DNA转运至宿主细胞核 4、病毒DNA整合到宿主染色体 5、以病毒DNA为模板转录RNA 6、在细胞中翻译Gag、Pol和Env蛋白 7、形成衣壳，RNA单链和反转录酶一起包装进衣壳。 8、形成病毒颗粒并分泌到胞外。 * * 逆转录病毒 病毒RNA 宿主细胞 RT RT 逆转录酶 cDNA 双链 插入 基因组DNA 逆转录病毒感染过程 病毒RNA * * 构建逆转录病毒载体： （1）构建重组野生性病毒：插入相关外源基因，改造成DNA载体（包括插入选择性标记），替代病毒的编码基因。 （2）制备辅助细胞（293T细胞），为载体DNA提供其丧失的功能。 （3）载体DNA导入辅助细胞，产生病毒载体。 （4）用病毒载体感染细胞，外源基因在宿主细胞中表达。 * * 逆转录病毒载体的缺陷： 1、只能转染处于增殖状态的细胞 2、所携带的外源基因不能太大。 3、感染依赖靶细胞表面受体的限制 4、理论上不扩散其它细胞，但某些情况会造成 野生型病毒爆发。 5、有致细胞癌变的可能。 6、逆转录病毒不能耐受纯化和浓缩过程。 * * 腺相关病毒(AVV ) 一种小的、非致病的、单链DNA病毒。是从属病毒，需 要其他基因才能复制。 结构： rep基因－－编码病毒的复制、整合功能所需蛋白 cap基因－－编码病毒结构组分 ITRs序列－－反向末端重复，定义基因的开始和 结束，制约DNA序列大小，包裹入 衣壳。 细胞对AVV病毒的亲和力高，AVV载体适用范围广泛。 * * 骨髓细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、肌细胞 选择原则: 1、较坚固，耐受处理，易于由人体分离，便于输 回体内。 2、具有增殖优势，生命周期长，能存活几个月或几年， 至病人的整个生命。 3、易于受外源遗传物质的转化。 4、在选用病毒载体时，目的基因的表达最好具有组织特异 性的细胞 3、选择靶细胞 （禁止使用生殖细胞，只能用体细胞） * * 1、骨髓细胞：最被重视和常用的靶细胞。 常用细胞： 优点：⑴易接受各种处理、⑵已积累丰富经验，⑶多数遗传疾病 涉及骨髓细胞、⑷源自骨髓的细胞遍布全身。 缺点： -骨髓干细胞含量少（占骨髓细胞0.1%） -治疗基因在核骨髓细胞表达时间短（几个月）。 -只有部分干细胞有活性 -造血干细胞分化可能导致基因失活。 -有些遗传疾病与骨髓干细胞无关。 2、肝细胞：是许多遗传代谢缺陷的靶细胞。 3、皮肤细胞：易于繁殖及转化。 4、淋巴细胞：易采集、分离，大量繁殖，连续 多次输入 5、癌细胞：肿瘤治疗常用细胞。 * * 方法： 1、物理法： 显微注射法 电穿孔法 基因枪技术 2、化学法： 磷酸钙沉淀法 DEAE-葡萄糖法 脂质体法 3、融合法 4、病毒感染法 4、基因的转移 * * 转染细胞后的筛选： 方法： 1、标记基因筛选法： 2、基因缺陷型受体细胞的选择性 3、基因共转染技术 4、分子生物学方法: 原位杂交 Southern杂交 斑点杂交 目的基因或标记基因作为探针。 * * 方法： （目的基因和标记基因的表达） 原位杂交、 Northern杂交、 RNA点杂交 （检测mRNA的转录） 免疫组化染色（检测基因翻译出的蛋白质) 5、外源基因表达的检测： * * 6、回输体内 将治疗性基因修饰的细胞通过不同方式回输 入体内，以发挥治疗效果。 如： -淋巴细胞经静脉回输入血 -造血细胞经自体骨髓移植 - 皮肤成纤维细胞经胶原包裹后埋入皮下组织 * * 1、肝专一性表达： 磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶启动子 2、肌肉专一性表达：肌苷激酶的调控片段 3、乳腺专一性表达： β酪蛋白，乳清酸蛋白 4、黑色素专一性表达: 酪氨酸和酪