第5章分子生物学方法(上)课稿.ppt

SDS是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 强还原剂巯基乙醇(或二硫苏糖醇，DTT)可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。 【SDS基本原理】 凝胶成分 丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 ?? SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液 PAGE：聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰 胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker) N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide， 简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网 状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明 度。是良好的电泳介质。 聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式： 单体：丙烯酰胺（Acr）； 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）； 催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）； 加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）； 产物：三维网状结构凝胶 聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals)的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redox systems)来完成的。催化体系主要有化学催化(AP-TEMED)和光化学催化(核黄素-TMTED)体系。 凝胶浓度与蛋白分离范围 凝胶浓度（％） 线性分离范围（KD) 15 12-43 10 16-68 7.5 36-94 5.0 57-212 SDS浓缩胶(5% Acrylamide)及分离胶配方表： 不连续电泳： 作用 缓冲液PH 凝胶浓度 浓缩胶 使蛋白样品浓缩 pH6.8Tris-Cl 低，2-5% 分离胶 使蛋白样品分离 pH8.8Tris-Cl 高，根据蛋白大小 电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。 灌制分离胶 隔绝空气 ddH2O 0.1%SDS:8% 异丁醇：8% Phylip软件包的应用 1，根据你的分析数据，选择适当的程序 如，你分析的是DNA数据，就在核酸序列分析类中选择程序（dnapenny，dnapars，dnamove，dnaml，dnamlk,dnainvar，dnadist，dnacomp ）如果分析的是离散数据，如突变位点数据，就在离散字符组里面选择程序。 2.选择适当的分析方法 如你分析的是DNA数据，可以选择简约法（DNAPARS），似然法（DNAML， DNAMLK），距离法等（DNADIST） 3.进行分析 选择好程序后，执行，读入分析数据，选择适当的参数，进行分析，结果自动保存为outfile，outtree。 Outfile是一个记录文件，记录了分析的过程和结果，可以直接用文本编辑器（如写字板）打开。 Outtree是分析结果的树文件，可以用phylip提供的绘树程序打开查看，也可以用其他的程序来打开，如treeview。 PAUP PAUP是最著名的系统发育分析商业软件。程序与平台无关。 PAUP使用一种称为NEXUS的数据格式。 PAUP对系统进化树进行重新排布时更加广泛，对支长迭代的收敛标准更加严格，因此，所找到的系统进化树同PHYLIP的一样好，或更好。 PAUP的数据格式(Nexus) 主要包括taxa，characters，assumptions，sets，trees，codons，distances，paup八个数据块。 对于一个常规的分析，taxa，characters块是必须的。而分析的命令可以通过菜单操作（mac），或者键盘命令(win,linux)，也可以在nexus文件中加入paup命令块 PAUP的Nexus的文件块 1.TAXA块 主要是定义所分析的数据（如分子序列）个数，以及这些数据的名称（如物种名称）。 2. CHARACTERS 块 主要是定义数据矩阵（如多序列比对结果）和其他一些相关的信息（如序列特征值，序列有效区域等） 3. ASSUMPTIONS块 定义了对数据的一些设定，如那些特征值是不需考虑的，怎么处理gap这个特征值等，用户自定义的一些数据也放在这块，如自定义的打分矩阵。 4. SETS块