细说匙羹藤对胰岛素抵抗小鼠脂肪组织蛋白的影响.docVIP

细说匙羹藤对胰岛素抵抗小鼠脂肪组织蛋白的影响 　　匙羹藤又名武靴藤、金刚藤，是一种主要分布于我国两广地区的传统草药，性苦味平，具有清热解毒之功效，传统用于治疗风湿关节痛，痈疖肿毒等，近年来，临床报道其具有降糖调脂的作用，实验研究也初步验证了其可通过改善胰岛素抵抗(insulin resistance , IR)进而防治2型糖尿病，且与激活脂肪组织P13 K信号通路有关。蛋白激酶B (PKB)是脂肪组织中胰岛素介导葡萄糖转运PI3 K信号通路中重要的调节因子，大量实验研究证实了脂肪组织PKB表达异常以及其磷酸化形式的表达或磷酸化程度的异常与IR形成与发展密切相关。本研究以IR KKAy小鼠为研究对象，观察匙羹藤对小鼠IR.的作用以及对脂肪组织中PKB表达以及其磷酸化形式的含量以及磷酸化比率的影响。 　　材料 　　1.动物 　　SPF级雄性6一7周龄，雄性KKAy小鼠18只，体重26g土3g;同周龄雄性C57BL/6)小鼠9只，体重22g土3g，购自中国医学科学院动物研究所，SCXK京2009 - 0004。动物饲养于北京中医药大学实验动物中心SPF实验室，动物室内设置12 h昼夜循环，并维持室温在23℃土29C，湿度在(55士10) %，动物采用单笼喂养，期间自由摄食、饮水，KK鼠料购自于中国医学科学院动物研究所。 　　2.药物与试剂 　　匙羹藤提取物由北京中医药大学中药学院提供:匙羹藤生药饮片Skg，加水煎煮3次，料液比分别为l: 10, 1: 10, 1: 8，煎煮时间分别为:1.5, 1.5, 1小时，分别过滤合并滤液，滤液减压浓缩至稠膏，70℃真空干燥，粉碎，过80目筛，得匙羹藤提取物0. 33kg;盐酸毗格列酮片:北京太洋药业有限公司，批号:小鼠胰岛素放射免疫试剂盒(Merck milli-pore公司);血糖试纸(日本爱科来试剂公司); PKB抗体(购自CST公司，货号:JHJ4685 ) ;P - PKB (Ser473 )(购自CST公司，货号:JHJ4060 ) ; P - PKB (Thr 308 )(购自CST公司，货号:JHJ4056 ) ; Trizol试剂盒(购自Invitrogen公司);PCR引物(购自生工生物工程上海有限公司);Real-time PCR扩增试剂盒(购自中原领先科技有限公司)。 　　3.主要实验仪器 　　低温高速离心机(3 K30 )(美国Sigma公司);稳压稳流电泳仪(美国Bio-Rad公司);垂直电泳槽(美国Bio-Rad公司);半干转电转印仪(美国Bi。一Rad公司);血糖仪(日本爱科来公司);Real一Time PCR仪(美国ABI 7500 );核酸紫外分光光度计(德国Biophotometer公司)。 　　方法 　　1.动物分组及给药 　　雄性6一7周龄KKAy小鼠18只，适应性喂养1周后，剪尾取血，测随机血糖值)13. 9mmo1/L者人选，27只全部人选。按照体重随机分组，分为模型组(DM) 9只，匙羹藤提取物组(GS) 9只。另取9只雄性C57BL/6)小鼠作为空白对照组(NC)。每日GS组小鼠按照2. 5群kg灌胃给药，共8周，DM组、NC组小鼠灌胃等体积的无菌水。 　　2.观察指标及检测方法 　　2. 1空腹血糖、空腹血清胰岛素:末次给药后小鼠禁食不禁水(00:00一08;00) 8小时后测定空腹血糖;摘眼球取血后静置3小时，3500转/分钟分离血清，采用放射免疫法测定空腹血清胰岛素水平。 　　2. 2胰岛素敏感指数(ISI)的检测:采用李光伟法，ISI二1/ (FPG x Fins)。 　　2. 3蛋白免疫印迹法检测PKB, P一PKB (Ser473 ) , P一PKB (Thr 308) , PDK:提取蛋白，采用Bradford法测定蛋白含量，蛋白变性一SDS一PAGE电泳(10% SDS一PAGE分离胶，5%浓缩胶分离蛋白，BIO一RAD电泳板一转印。封闭--+一抗(1: 1000比例稀释)孵育(4℃过夜)。二抗(1:10000比例稀释)孵育，室温放置1h一清洗:TTBS洗3次，每次Smin-rECL发光。用IPP软件对扫描图象的目的条带进行灰度分析。 　　2. 4实时荧光定量PCR法检测PTENmRNA; 实验结束后，拉颈处死各组小鼠，在冰上迅速取出附皋脂肪垫，并置入液氮中以备检测用。(1)总RNA提取:在预冷的研钵中加人液氮进行快速研磨组织，并用Trizol一步法提取脂肪组织总RNA，并以核酸紫外分光光度计法检测RNA的浓度与纯度。(2)引物序列:PTEN上游引物:5#39;-CTGCAGAGTT