生物化学第一章蛋白质研究报告.ppt

2. 蛋白质的化学组成 一.蛋白质的元素组成 主要的： C H O N S 50~55% 6~8% 20~23% 15~18% 0~4% 微量的： P Fe Cu Zn Mo I Se 大多数蛋白质含氮量较恒定，平均16 %，即1g氮相当于6.25g蛋白质。 6.25称为蛋白质系数。 样品中蛋白质含量=样品中的含氮量 × 6.25 酪氨酸的?max＝275nm，?275=1.4x103; 苯丙氨酸的?max＝257nm，?257=2.0x102; 色氨酸的?max＝280nm，?280=5.6x103; 2.氨基酸的离解性质 氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。 在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化 对于侧链含有可解离基团的AA pI取决于两性离子两边pK’值的算术平均值 酸性AA：pI = (pK’1 + pK’R-COO- )/2 碱性AA：pI = (pK’2 + pK’R-NH2 )/2 反应特点 A.为α- NH2的反应 B.在常温，中性条件，甲醛与α- NH2很快反应，生成羟甲基衍生物，释放氢离子。 应用：氨基酸定量分析—甲醛滴定法（间接滴定） A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。 B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。 C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1：1） D.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。 (3) 与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应 反应特点 A.为α- NH2的反应 B.氨基酸α- NH2的一个H原子可被烃基取代(卤代烃) C.在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成二硝基苯氨基酸 应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸 A.虽然多肽侧链上的ε- NH2、酚羟基也能与DNFB反应，但其生成物，容易与α- DNP氨基酸区分和分离 ★首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构 A. B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸 C.分离DNP-氨基酸 D. 由Edman于1950年首先提出 为α- NH2的反应 用于N末端分析，又称Edman降解法 肽链（N端氨基酸）与PITC偶联，生成PTC-肽 环化断裂：最靠近PTC基的肽键断裂，生成PTC-氨基酸和少 一残基的肽链，同时PTC-氨基酸环化生成PTH-氨基酸 分离PTH-氨基酸 层析法鉴定 Edman降解法的改进方法--- DNS-Edman降解法 用DNS(二甲基萘磺酰氯)测定N端氨基酸 原理DNFB法相同 但水解后的DNS-氨基酸不需分离，可直接用电泳或层析法鉴定 由于DNS有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高几到十几倍 可用于微量氨基酸的定量 用Edman降解法提供逐次减少一个残基的肽链 灵敏度提高，能连续测定。 多肽顺序自动分析仪 样品最低用量可在5pmol 4. 肽 一.肽的概念 肽 肽键 肽链 N端 C端 二肽 三肽 多肽 寡肽 多肽链 氨基酸残基 肽单位 二.肽的命名 三.肽的理化性质 1.在晶体或溶液中以两性离子状态存在 2.熔点高 3.其酸碱性决定于N端氨基、C端羧基和侧链R基 4.双缩脲反应 5.与氨基酸类似的反应：DNFB DNS PITC 反应等 四.常见的多肽（天然活性肽） 肽和肽键 氨基酸残基及肽单位 3.天然存在的重要多肽 二.蛋白质的一级结构 一级结构 氢键 C?总是处于折叠的角上 AA的R基团处于折叠的棱角上并与之垂直 两个AA之间的轴心距为0.35nm 氢键主要在链间/同一肽链不同部分间形成 几乎所有肽键都参与链内氢键的交联 氢键与链的长轴接近垂直 平行肽链间以氢键从侧面连接的构象 a-发夹结构 β-发夹 a-β结构 a 蛋白 β蛋白 a+β蛋白 a/β蛋白 维系蛋白质三维结构的作用力 蛋白质四级结构的结构特征 正常血红细胞 镰刀状红细胞贫血 蛋白质的一级结构的变异与分子病 氨基酸顺序 1 2 3 4