遗传实验参考 转基因果蝇的杂交重组和鉴定.docxVIP

转基因果蝇的杂交重组和鉴定 生06 郑华 2010030065 同组成员：刘紫薇 潘周娴 贺佳琳 王宇宁 实验日期：2012年4月4日至5月27日 1. 实验目的： 把插入在同一个染色体上的不同目的基因（分别处于两个品系果蝇中）通过重组交换整合到同一品系果蝇的同一染色体上，并得到可以稳定保存的品系（balanced或homozygous）。 2. 实验原理 转基因果蝇（transgenic fly）是将带有目的基因的质粒通过显微注射转入白眼果蝇卵中，这些质粒上一般带有P转座子序列（P elements are transposable pieces of DNA that randomly insert themselves into genomic DNA），使得目的基因可以插入到果蝇染色体中。一般使用白眼果蝇的卵进行显微注射，质粒上带有的mini-white基因（红眼）可以作为转基因成功的标记（marker），带有目的基因的果蝇将成为红眼果蝇。mini-white的表达量决定了果蝇眼睛红色的深浅，这与目的基因插入位置和copy数目有关，入位置附近的染色体结构和启动子决定mini-white表达量，纯和果蝇比杂合果蝇表达量也高，有多个插入位点的比单个插入位点的表达量高，一般情况下只有一个插入位点。 有基因A的转基因果蝇系tA和基因B的转基因果蝇系tB，A和B分别插在tA和tB的三号染色体上（t表示transgenic）。带平衡子的果蝇相应染色体不能发生重组，使得杂交过程和鉴定方法更为简单。 另外，还需要应用到一个UAS-Gal4系统的神经细胞的driver，为GMR-Gal4，进行重组成功的鉴定。 GAL4/UAS系统是目前果蝇中十分常用的实验系统（见下图说明）。该系统利用组织特异性的启动子或增强子，将GAL4基因与启动子或增强子相连接,建立GAL4转基因系，通过这种启动子以细胞和组织特异性的方式来控制GAL4的表达。另外，将UAS与靶基因融合，建立带有UAS-靶基因的转基因系。在杂交后代中,特异性表达的GAL4能以同样的方式调节UAS-靶基因的表达。 3. 实验材料 转基因果蝇A、B/Ser(翅膀缺刻)、+/Sb balancer（白眼，平衡子Sb，短刚毛）的果蝇以及GMR-Gal4果蝇。 其中，tA果蝇系为纯合体，转入Tau基因，该转基因与GMR-Gal4果蝇系进行杂交，其在GMR-Gal4的驱动下，产生子代的成体果蝇眼睛缺陷，表现为发育不全。tB果蝇系为纯合致死，带有一个Serrate（翅膀缺刻）的balancer，其自身带有GFP基因，能自发绿色荧光，在荧光显微镜下可观察。 本实验中可能用到的balancer为： 染色体 Balancer 显性表型标记（dominant phenotypic marker） 纯合（homozygous） 3 TM3 Sb（短刚毛） 致死（lethal） 3 TM3 Serrate（翅膀缺刻） 致死（lethal） 4. 实验方案 因为要使A基因和B基因在同一条染色体上，又要稳定遗传，保证自由重组或者交叉互换都不会带来变异，因此目标蝇应含纯和致死的平衡子，即为AB/Sb或者AB/Ser。我们选择的是得到AB/Sb。其自交结果如下，可以保证自交稳定。 AB Sb AB B纯和致死 AB/Sb,保持性状稳定 Sb AB/Sb,保持性状稳定 Sb纯和致死 我们小组采用了两套方案，第一套方案和多数其他小组差不多，风险较小，但实验时间较长；方案二比方案一少杂交一代，但是得到所需要的目标蝇在杂交后代中的概率更小，需要更多的杂交后代以保证能够跳出目标果蝇。两种方案具体如下：未加注明的性状默认为野生型。其中蓝色的字是实际操作时使用的果蝇数目和日期。 4.1. 方案一 P：13只A/A♀ × 6只B/ser(残翅) ♂（4月10日 22:00） ↓ F1:, A/B（非残翅），A/ser(残翅) F1: 11只A/B♀ × 5只+/Sb♂(短刚毛) （4月23日23:00） ↓ F2: A B AB + + A/+ 红眼 B/+ (红眼绿色荧光) AB/+ (红眼绿色荧光) +/+ (白眼) Sb A/Sb (红眼短刚毛) B/Sb (红眼绿色荧光短刚毛) AB/Sb (红眼绿色荧光短刚毛) +/Sb (白眼短刚毛) 此处挑选红眼短刚毛的雄性。因为该步骤需要将红眼短刚毛的果蝇挑出，一个一个分离出来与GMR-GAL4/GMR-GAL4杂交，已验证其是否含有A基因。而如果一个瓶子里雌果蝇只有一只，产卵量较少，卵不易孵化，因此此处选择的红眼短刚毛果蝇应为雄性。因为用紫外线照射检验荧光可能会影响雄蝇的生殖能力，故在对B基因的检测放在对A基因检测的后面。出于同样原因，在GMR-GAL4/GMR-GAL4雌