第14章基因重组和基因工程.pptVIP

基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering 第14章 DNA克隆、测序与重组技术的历史 1973年，Stanley Cohen等人首次获得体外重组DNA的分子克隆 1977年，Allan Maxam和Walter Gilbert的化学裂解DNA测序问世 不久，Sanger 等的双脱氧测序法 20世纪90年代启动人类基因组计划(human genome project，HGP) 重组DNA技术学(Recombinant DNA Technology) 第一节自然界DNA重组和基因转移是经常发生的 DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature DNA重组 发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组（general recombination）。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。 一、同源重组是最基本的DNA重组方式 Holliday模型的4个关键步骤： 两个同源染色体DNA排列整齐； 一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体； 通过分支移动产生异源双链DNA； Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为： 片段重组体 （见模型图左边产物）： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组 体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。 拼接重组体（见模型图右边产物）： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。 Holiday中间体 5′ 片段重组体 拼接重组体 二、细菌的基因转移与重组有四种方式 （一）接合作用 当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。 可接合质粒如 F 因子(F factor) 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。 质粒 （二）转化作用 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用 (transformation)。 例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。 （三）转导作用 当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。 λ噬菌体的生活史 溶菌生长途径 (lysis pathway) 溶源菌生长途径 (lysogenic pathway) 三、位点特异重组，即特异位点间发生的整合 位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。 λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。 （一）λ噬菌体DNA的整合 （二）细菌的特异位点重组 沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。 hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。 沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变 （三）免疫球蛋白基因的重排 免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(?和?)，一个编码重链。 轻链的基因片段： 重链的基因片段： 重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重组酶基因rag (recombination activating gene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。 V J 分子内转酯反应 单链切开 转移核苷酸 修复、连接 免疫球蛋白基因重排过程 四、转座重组 由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。 大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。