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真核细胞DNA复制中的酶和蛋白质 第九小组 刘少英、马丹炜、罗孟军、王萍 主讲：刘少英 细胞周期 DNA 复制有关酶 DNA聚合酶 DNA引发酶（PRIMASE） 是DNA合成中合成RNA引物的酶，引发酶行使2个功能：首先在起点处起始先导链的合成。其二在延伸中帮助岗奇片段的反复起始。 DNA解旋酶 DNA拓扑异构酶 单链结合蛋白（SSB） 核酸酶（nucleases） 是通过水解磷酸二酯键消化核酸的酶，包括DNase 和 RNase两类，各类还包括外切酶和内切酶两类。在复制中需要三个特定的核酸酶活性：校正需要3‘-5’的外切酶活性、引物的去除需要RNaseH、5’-3’外切酶活性。 DNA连接酶 DNA连接酶是在双链DNA中催化相邻核苷酸形成磷酸二酯键的酶。她要求5‘断的核苷酸必须有完整的磷酸基团、3’端必须有完整的羟基。在真核生物中连接酶需要ATP。DNA连接酶控制所有DNA修复途径的最后阶段，哺乳动物有4种连接酶活性，DNA连接酶I是涉及后滞链修复的基本酶。 非洲爪蟾卵提取物中MCM2-7复合物在染色质上复制起始复合物周围的分布 摘要：MCM2-7复合物被认为具有真核生物DNA复制解旋酶功能。它通过复制起始复合物（ORC）、CDc6、Cdt1而结合到DNA 链上，它在G1-S的过度期被CDc45和蛋白质激酶CDc7、Cdk2所激活。但是，在染色体上，结合的MCM复合物数量远比ORC复合物的数量多。为了弄清楚原因，本实验用非洲爪蟾（XENOPUS）卵提取物为材料，检测了结合在线性DNA片段上的各种蛋白质进行了测定。实验发现，当DNA片段为80bp时，ORC和MCM之比为1：1；当DNA片段较长时，MCM的比率迅速上升，证明MCM广泛分布在结合有CDc45的DNA周围。MCM复合物并不是DNA复制的限制物， 摘要（续） 它们在CDc7存在的情况下被磷酸化，他们能诱导Cdk2 依赖的CDc45的附着。非洲爪蟾卵提取物实验表明，DNA复制的起始包含着复杂的、分布广泛的、具有起始作用的MCM2-7复合物。 染色体DNA的复制需要三个系统参与 非洲爪蟾胚胎期细胞从有丝分裂末期至G1期末复制起始事件 固定在线性DNA碎片上的前复制复合物的形成和激活 ORC和MCM被有效地富集于82-bp以上的DNA片段上 MCM的附着与DNA长度有关，而ORC与DNA长度无关 侧位MCM复合物紧紧附着于染色质 附着于DNA上的CDC45是DNA复制的速度限制因素 MCM复合物的磷酸化是CDC7依赖的 CDC45在染色体上的附着受放线菌素D所促进 DNA复制起始模型 结论 一、MCM复合物的附着需要82bp的DNA片段，ORC的附着也需要80bp的DNA片段，被认为是G1期MCM附着所需的DNA长度。 二、DNA片段长度超过82bp时，MCM复合物的数量显著增加，而ORC保持不变；MCM复合物广泛分布在ORC周围的DNA片段上。 三、MCM复合物在DNA片段上的附着需要CDC6和CDT1。 在没有ORC、CDC6、CDT1存在的DNA片段上没有MCM附着。 四、MCM复合物附着后，ORC去除不会降低DNA合成的效率。ORC后的MCM具有支持复制起始的作用 结论（续） 五、侧位MCM复合物被CDC7结合，MCM4被CDC7依赖的反应磷酸化；在放线菌素D存在的情况下，CDC45：MCM约为1，表明每个侧位MCM可以招募一个CDC45。 六、DNA复制的起始事件被有规律地隔断，其原因是在CDC45附着的一定距离的MCM复合物处于不活动状态。 七、研究表明，MCM复合物在哺乳动物细胞中普遍存在，人类的细胞核中有106个MCM复合物；中国仓鼠卵巢细胞中MCM复合物在G1期增多，在GI/S期的过度期达到最高。 该图显示一小段染色体DNA片段如何跨过细胞周期。 第一系统：起始识别系统。该系统负责在DNA适当的位置复制起点。充当这一角色的是ORC，它被附吸在复制起始处，并行使起始功能，在这个间期ORC都结合在DNA上。 第二系统：复制准许系统。他保证这些“起始”在一个细胞周期仅激活一次。他在M期末激活，并支持MCM2-7复合物的附着，准许进入S期开始复制。 第三系统：S期促进因子（SFP）。提供复制叉起始的触发器。他包括2种活性成分： CDc7蛋白质激酶、S期促进的细胞周期依赖激酶CDK。 CDC 细胞分裂周期蛋白 CDK 细胞周期蛋白依赖激酶 MCM 酿酒酵母转录因子， 蛋白质印迹法分析 （主要了解DNA和ORC、MCM的空间关系） 1道：当量的磁珠（未加DNA），检测不出MCM和ORC2 2-6道：磁珠被偶联到3kb的DNA蓝印碎片（通过PCR得来）上。然后和非洲爪蟾卵细胞溶质保温20分钟，通过分离、洗涤再用蛋白质印迹法分析。 2道表明有DNA片段存在时，