第二章PCR技术及其应用.ppt

第二章 PCR技术及其应用 PCR自动化热循环仪——PCR仪 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的反应体系和方法 完整性：避免反复冻融 浓度：应适当,过高导致非特异性增加,过低则扩增产物太少 引物浓度为0.1-0.5 ?mol/L；浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 引物在线设计网址： /cgi-bin/ primer/primer5_www.cgi 退火(复性)温度与时间： 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度 可根据引物结构来确定其退火温度,但它只是对引物本身而言,并不一定是该试验的最佳条件, 适当调整。如果在试验中总是没有产物生成,就应该适当降低退火温度,只要出现产物尽管带型不好(如出现杂带等),可以适当改变某些条件以进一步优化。 经典循环参数（500bp以内） PCR常见问题分析 问题一：无扩增产物 PCR常见问题分析 PCR常见问题分析 PCR技术的应用 （二）扩增：用94℃变性3分钟，94℃变性1分钟，61℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，循环30轮，进行PCR。最后一轮循环结束后，于72℃下最后延伸5分钟，使反应产物扩增充分。 （三）电泳鉴定：2%琼脂糖凝胶 问题与讨论 1、简述PCR基本原理 2、进行一次成功的PCR反应注意哪些问题。 （2）荧光域值(threshold)的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 荧光域值是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold =10×SD×cycle 3-15 Ct值的确定 （3）Ct值与起始模板的关系 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt：荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。 在阈值线设定以后，它是一个常数，我们设为M。 方程式(1)两边同时取对数得: logM=logX0(1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: log X0= -log(1+Ex)*Ct+logM (3) Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值，就可计算出样品中所含的模板量。 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。 确定未知样品的C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量 Sample 25 （4）荧光标记方法 ???? 可分为两种： —荧光探针（Taqman） —荧光染料（SYBR Green） SYBR Green 不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物，其最佳比例一般是0.01:0.5μM，关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究 高浓度引物 低浓度引物 反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析，如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆，扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。 已知序列 未知序列 未知序列 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 多重PCR 用于检测特定基因序列的存在或缺失。 电泳 引物 LP-PCR（Labelled primers) 利用同位素、荧光素等对PCR引物进行标记，用以直