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插入失活法的应用 　　【摘 要】质粒是基因工程的常见载体，质粒的结构和重组质粒的筛选和鉴定是高考的热点问题之一，本文通过分析质粒结构和插入失活法，结合2016年全国卷理综第40题，探讨重组质粒的筛选和鉴定问题。 　　【关键词】质粒载体；标记基因；插入失活 　　质粒是基因工程的常用载体，质粒结构和功能也是高考热点问题之一，2016年全国卷理综第40题再一次以质粒图谱为基础，考查了质粒作为载体应具备的条件，重组质粒导入受体细胞的筛选与鉴定问题，而这一方面的知识在教材中讲解较少，理解起来较抽象，难以透彻的掌握这个知识点，给解题带来困难。本文特针对质粒结构及重组质粒筛选与鉴定问题进行补充，以期能对老师教学和学生解题带来帮助。 　　载体是一种可将外源DNA片段送入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具。目前已构建成的载体主要有质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体等多种类型。其中最常使用的是质粒载体。 　　一、质粒载体 　　质粒是一种独立于细菌拟核DNA之外，具有自我复制能力的小型环状DNA分子。由于天然质粒作为载体存在着不同的局限性，科研人员对其进行了修饰改造。作为高质量的克隆载体的质粒必须具有如下特征：1.有复制原点，这是质粒在宿主细胞内能自主复制的基本条件。2.有多种限制酶的单一识别位点，以供外源基因的插入。3.有标记基因，理想的质粒载体应具有两种抗菌素抗性基因，以便从平板中直接筛选阳性重组子。4.相对分子质量较小。5.有安全性，作为克隆载体应当只存在有限范围内的宿主；在体内不进行重组；不会发生转移；不产生有害性状；不会离开宿主而自由扩散，因而是相对安全的。 　　二、插入失活 　　将外源DNA片段插入到载体的标记基因中使此基因失活，丧失其原有的表性特征，称为插入失活。pBR332是研究最多，应用最广泛的质粒载体之一，该质粒有两个标记基因， 四环素抗性基因（Tetr）和氨苄青霉素抗性基因（Ampr），有8种限制酶识别位点位于Tetr内部，另外有2种限制酶的识别位点是存在于该基因的启动区内，在这10个限制位点上插入外源DNA都会导致Tetr的失活，这时含有DNA插入片段的pBR322将使宿主菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。3种限制酶的识别位点位于Ampr内，在这些位点插入外源DNA则会导致Ampr的失活，这时含有DNA插入片段的pBR322将使宿主菌抗四环素，但对氨苄青霉素敏感。插入失活是检测重组质粒的一种十分有效的方法。 　　三、实例应用 　　2016年全国卷理综第40题是一道很好的考查质粒结构和插入失活效应的题目： 　　某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题： 　　（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有______（答出两点即可），而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。 　　（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______；并且______和_____的细胞也是不能区分的，其原因是______。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有______的固体培养基。 　　（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自______。 　　分析题目可知，本题考查了基因工程质粒载体特点、插入失活效应在重组质粒筛选中的应用及噬菌体侵染细菌后，合成子代噬菌体一切的原料来源于宿主细胞。分别解析如下： 　　（1）小题考查了质粒作为基因工程的载体应具备的基本条件，参考答案：具有复制原点；具有标记基因；具有限制酶的单一识别位点。 　　（2）小题考查插入失活及重组质粒的筛选问题，将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，得到的大肠杆菌表型有四种：未被转化大肠杆菌，对四环素和氨苄青霉素都敏感，即AmpsTets表型；含有环装的目的基因的大肠杆菌，即AmpsTets表型，含有质粒载体的大肠杆菌，即AmprTetr表型；含有插入了目的基因重组质粒的大肠杆菌，即AmprTets。若用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被