外源基因的表达.ppt.ppt

* 胰岛素最初是以一条单链分子的前体形式合成的，即胰岛素原（Proinsulin）。它可认为是由ABC三条肽链连接而成。具体是C肽的一端通过两个碱性氨基酸残基62、63与胰岛素A链的N末端相连，另一端通过另外两个碱性氨基酸残基31、32与胰岛素B链的C末端相连。在细胞高尔基体中，胰岛素原被贮存在储存颗粒内，并在肽酶的催化下，切去C肽而形成活性胰岛素。 * 胰岛素原是胰岛素的前身,需要经过酶切去除C 肽,方成为有功能的胰岛素。 * * * * 常用的哺乳动物细胞种类 鼠源性：NIH3T3 （小鼠胚胎成纤维细胞系 ）, CHO（中国仓鼠卵巢细胞） 人源性：293（人肾上皮细胞系），HeLa（源自一位美国妇女 Henrietta Lacks 的子宫颈癌细胞的细胞系） ATCC（American Type Culture Collection ）-1925年建立﹐是世界上最大的﹑保存微生物种类和数量最多的机构﹐保存病毒﹑衣原体﹑细菌﹑放线菌﹑酵母菌﹑真菌﹑藻类﹑原生动物等约 29000株 中国典型物种保藏中心（武大） 五、重组子导入宿主细胞的方法 磷酸钙介导的转染 阳离子脂质体介导的转染 Lipofectamine invitrogen 公司产品 DEAE-葡聚糖介导的转染 电穿孔转染 病毒转染 Gene Gun 磷酸钙沉淀法 将外源DNA与CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，逐滴加入到不断搅拌的HEPES-磷酸钙溶液中，形成DNA－磷酸钙共沉淀复合物。 然后用吸管将沉淀复合物加到培养的哺乳动物单层细胞表面，细胞可通过内吞作用将复合物吸收到细胞内。 转化率在10%左右。 脂质体介导的转染 脂质体（liposome）是由人工构建的磷脂双分子层组成的小球，DNA包裹在脂质体中，通过融合或吞噬作用被细胞吸收。 基因导入方法: 电穿孔法 (Gene transfer by electroporation) 外源基因在昆虫细胞中的表达 载体 质粒载体 杆状病毒表达载体 常用的昆虫细胞株 Sf9, Sf21, S2, Ea4 昆虫杆状病毒（Bac-to-Bac）表达系统 主要包括： 1）pFastBac受体质粒。目的基因可克隆到该质粒表达盒中，表达盒受到杆状病毒启动子的调控。 2）大肠杆菌DH10Bac。内含杆状病毒穿梭载体（Bacmid）和辅助质粒，在辅助质粒的帮助下，可以将pFastBac受体质粒中的重组表达盒转座到Bacmid中。 3）昆虫细胞。 Bac-to-Bac? Baculovirus Expression System 七、基因表达的检测 1.转录水平检测：RT-PCR，Real-time PCR，northern blot，基因芯片等。 2.翻译水平检测：western blotting, ELASA，免疫组化，原位杂交，免疫沉淀，免疫荧光抗体等。 3.直接检测，如报告基因、融合荧光蛋白等。 RT-PCR， Real-time PCR RT-PCR：通过电泳，EB(或EB替代品)显色，成像，再通过灰度分析软件进行分析，得出结果，一般用于相对定量分析。 Real-time PCR：通过实时检测PCR体系中的荧光基团，从而达到实时报告扩增结果，进行定量或相对定量分析。 RT-PCR，Real-time PCR原理示意图 首先提取总RNA或mRNA，反转录成cDNA，即互补DNA序列，再通过RT-PCR，real-time PCR 方法对cDNA进行定量分析。 电泳及图像采集与分析 RNA表达量的数据分析 RNA电泳 数据分析 数据分析 Western Blotting 主要基因工程表达体系比较 表达体系 产 物 产生部位 培养方式 提 纯 产物活性 潜在危性 大肠杆菌 多肽蛋白质 菌体内 容易 一般 对原核好 不大 融合蛋白质 部分高产 对真核差 酵 母 多肽蛋白质 菌体内 容易 菌体内 真核的接近 不大 糖基化蛋白 外分泌 可高产 稍复杂 天然产物 哺乳动物 完 整 外分泌 较难，成本高 简单 可达天然 需注意