13第十三讲-1目的基因的获得幻灯片.pptVIP

1 PCR技术获得目的基因 1.1 已知序列基因的PCR扩增 1.2 RT-PCR 1.3 RACE (cDNA末端的快速扩增) 1.1 已知序列基因的PCR扩增 ⑴引物设计； ⑵引物效果检验和PCR参数确定。 1.2 RT-PCR 原理： 利用逆转录酶能将mRNA逆转录成cDNA的特性，通过合适的引物，将细胞内的mRNA逆转录成cDNA。 然后，通过PCR技术，将痕量的cDNA扩增成大量的双链DNA。 RT-PCR的优点： ⑴不需要纯化mRNA，总RNA就可以作为合成单链cDNA的模板； ⑵单链cDNA合成后其3‘端要进行同聚物加尾，不会丢失末端的最后几个核酸，可得到相当于mRNA5’末端的比较完整的序列。 1.3 RACE 以mRNA为模板，反转录合成cDNA第一链，然后用PCR技术扩增从某个特定位点到3‘端或到5’端之间的未知核苷酸序列。 这里的3‘端和5’端是针对mRNA而言。 RACE的技术流程 ⑴分析核心区段 经过比对分析，找出同源性较强的序列，然后根据核心序列设计引物。 来源：蛋白质、cDNA RACE的技术流程 ⑵ 设计简并引物和扩增核心区域