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影响PCR扩增因素的分析 邱先伟 (甘肃农业大学食品科学与工程学院 12级生物工程，甘肃 兰州 730070) 摘要: PCR的发展可以说是从DNA合成酵素的发现缘起。DNA合成酵素最早于1955年发现 (DNA polymerase I), 而较具有实验价值及可得性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现, 但由于这个酵素是一种易被热所破坏之酵素, 因此不符合一连串的高温连锁反应所需。随着经济的全球化，PCR技术的广泛应用，研究PCR技术的影响因素闲的愈来愈重要。 关键词: 多聚酶链式反应 PCR扩增技术 多重PCR 前言: 关于1983年Mullis等发明了种特异性DNA体外扩增技术—聚合酶链式反应PCR种体外模拟体内DNA复制核酸扩增技术少量DNA分子模板经过变性-退火-延伸多次循环已接近指数扩增形式产生大量目标DNA分子短短几十年该技术已经成常用、也重要分子生物学技术之其应用范围从基本基因扩增扩展基因克隆、基因改造、传染病源分析、遗传指纹鉴定等甚至扩展许多非生物领域该领域衍生出新方法更层出穷。 1．PCR技术的原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍[1]。 聚合酶链反应(Polymerase ChainReaction，PCR)，又称无细胞克隆技术(FreeBacteria Cloning Technique)，是一种根椐生物体内DNA复制的某些特点而设计的，在体外对特定DNA序列进行快速扩增的技术。 2．PCR技术的发展 2.1 常规PCR检测 对细菌进行分类鉴定的常规PCR技术，主要是以高度保守的特定基因序列的基础上建立起来的，如核糖体RNA(rDNA)、gyrB基因、toxR基因等。自6O年代末，Woese首次运用rDNA分析生物的系统发育以来，rDNA数据库快速扩大，已成为细菌多样性、系统进化与发育研究广泛采用的序列。细菌的16SrDNA基因核苷酸序列具有高度保守性，它的序列变化与进化距离相适应，被称为一种进化分子钟。由于其进化速度大约是每五千万年发生1％的碱基变化，所以适用于种以上水平的鉴定。研究细菌16SrDNA最直接的方式就是通过基因测序并与Genbank、EMBL、DDB等国际通用的数据库比对，根据同源性的大小确定细菌种的归类。23SrDNA基因也是非常保守的序列，由于它与16SrDNA基因是线性串联排列，在此基础上就发展出利用16S-23SrDNA基因间区序列来对细菌进行鉴定的方法。这个基因区段的进化速度高于16S rDNA，因此可以发展成为细菌种甚至株的鉴定方法。除此以外，还有其它一些高度保守的序列，如gyrB基因(细菌中广泛存在的一种编码DNA的拓扑异构酶Ⅱ的B亚基的单拷贝基因)、toxR基因(弧菌中的毒素表达调控蛋白基因)等也越来越广泛的被用于对病原性细菌进行分子生物学鉴定。 2.2 多重PCR技术 多重PCR技术是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型PCR扩增技术，其检测原理与传统PCR相同.如果存在与各引物对特异性互补的模板，只不过是在同一反应体系中加入1对以上的特异性引物，那么就可以同时在同一个反应管中扩增出l条以上的目的DNA片段。使用这一方法可以同时检测1个以上目的基因或者借助其交叉限制进行确认。，可同时检测多种病原微生物。该技术自1988年Chamberlain首次应用于杜氏营养不良症(Duchenne musculardystrophy)基因外显子缺失的检测以来，已经在遗传病诊断、转基因鉴定、病原体检测等各个领域成功的得到应用。[2] 3.影响PCR技术的因素研究进展 PCR 扩增影响因素初探 多聚酶链式反应(Polymerase chain reaction)简称PCR技术,是一种体外扩增特异DNA 片段的技术，此法操作简便,可在短