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紫外—可见分光光度法 目 录 紫外可见光谱学原理和应用 仪 器 样品处理及测定 方 法 二极管分光光度计的特性 1.基本原理 电磁波谱：无线电波、红外线、宇宙射线、x射线、紫外线、可见光 波长范围：200-800nm 波长和频率： E=h ν ν =c / λ λ 越短，E越高 紫外—可见光谱的来源： 辐射作用于物质，发生反射、散射、吸收、荧光、磷光、光化学反应。通常测量紫外—可见光谱时我们希望只发生吸收。 分子内电子跃迁导致谱带变宽，产生吸收光谱 2. 定性分析： 鉴定谱图和结构 同一性的认证 颜 色 其他定性信息 蛋白质的熔点测定 酶活性 3. 定量分析： 朗伯—比尔定律： A = εb c (ε为摩尔吸光系数) 多组分的分析 叠加性原理：一种混合物在任何波长下的吸光率 等与混合物中各组分在该波长下的A之和。 浓溶液的不适用性 化学偏离与仪器偏离 4. 间接测量： 化学衍生法 分光广度滴定 酶动力学分析 1.仪器设计 分光光度计的组成 产生一定光谱宽度的电磁辐射光源 色散装置：从光源发射宽的电磁波中选择特定的波长 样品区域 检测器:测量辐射强度 传统的分光光度计适用于测量光谱中单点吸光度 二极管阵列分光光度计比较：样品和色散元件的相对位置次序相反，称为反向光路 按构型分 单光束设计：提供高的光通量，灵敏度高；但光源漂移产生较大误差 双光束设计：矫正漂移。斩光器以一定速度旋转，使空白和样品的交替测量每秒进行数次。缺点，降低了光的能量和灵敏度 分光束设计：分裂器将光分成两束，同时穿过参比和空白，到达两个分开但一样的检测器，可同时测定样品和空白 双波长设计：同时测定两个波长，如样品中两个同时发生的反应 2.主要仪器参数（可能影响吸光度测量值准确度及精确度的一些仪器参数） 光谱分辨率 波长准确度及精确度 线性动态范围 漂移 影响测光准确度和精确度的因素：杂散光和噪声 杂散光：检测到选定波长带宽以外的任何波长 光。 T =( I + I s ) / ( I 0 + I s ) 噪声 光子噪声：在测量低浓度低吸光率样品时，影响精确测量两束高强度的光之间的微小差别。 电子噪声：是固有的，与测定的光强度无关。在高吸光度样品的信号很小时影响大 液体样品 固体样品 弱吸收 强吸收 干扰 光化学问题 动力学光谱法 固相光谱法 多元校正—多组分测定 二极管阵列分光光度计的特点 二极管阵列光谱学的优点 二极管阵列光谱学的缺点 参考文献：Tony owen著, 现代紫外—可见光谱学基础，1997，12-5965-5123E张剑荣，戚苓,方惠群编，仪器分析试验，科学出版社，1999曾永昌，向立人，周在德编，仪器分析，四川大学出版社，1992G.W.尤因著，华东化工学院分析化学教研组译，化学分析的仪器方法，1986罗国安，邱家学，王义明编，可见紫外定量分析及微机应用，上海科学技术文献出版社，1988 * * 短波长的紫外光能量高，这种成份导致了皮肤晒黑。 适用含量范围: 10-5%～50% 几乎所有金属元素的定量分析 0.01 mol/L时, 粒子相互影响 电荷分别改变. ε也改变. 浓电解质中有类似效应. 化学:缔合,离解,溶剂化,PH变化等 仪器:单色光不纯. 峰值处测量可改善 该方法能分析复杂的混合物和图谱相似的简单混合物。 用最小二乘法计算的偏差表明了标准光谱和样品光谱的拟合程度，同时也说明了分析结果的准确性。 简单联立方程式 最小二乘法 偏最小二乘法（PLS）,关键组分的回归法（PCR）,多重最小二乘法（MLS） 多组分分析方法 SBW/NBW≤0.1 导数光谱法 Beer定律：A=abc 一阶导数： 如果控制I0不变，则 ,而 结论：A’信号也正比于c， 在原拐点处灵敏度最大 高阶导数光谱同样适用 导数光谱的特点： 随着导数阶数的增加，峰越来越尖锐，灵敏度提高 信噪比随导数的 阶数增加而降低 原谱 一阶导数 二阶导数 快速采集，多波长同时测定，灵敏度高，有统计学意义，很高的稳定性和可靠性，敞开式的样品室 分辨率较低，散射光严重，样品会