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高效液相色谱（HPLC）简介 盛 卫 坚 目 录 1, 液相色谱分析法的发展 2, 高效液相色谱的特点 3, 高效液相色谱仪简介 4, 液相色谱法介绍 5, 分析方法的选择 6, 实际分析操作过程 1、液相色谱分析法的发展 20世纪初： 俄国植物学家茨维特提出经典液相色谱法。经典液相色谱法包括柱色谱、薄层色谱、纸色谱。 20世纪60年代末： 　　　随着色谱理论的发展、高效细微固定相的开发、高压恒流泵及高灵敏度检测器的应用，高效液相色谱法得到了突破性的发展。 2.1 HPLC的特点（一） 3、液相色谱仪简介 贮液罐A 高压输液泵A 阻尼器A 贮液罐B 高压输液泵B 阻尼器B 初步混合器 压力传感器 混合器 进样器 色谱柱 检测器 谱图输出 3.1　高效液相色谱仪构造 3.3　阻尼器介绍 阻尼器----消除、减轻往复式柱塞泵输出的压力脉动。 3.4.1 检测器简介（一） 3.4.2 检测器简介（二） ◆ 电导检测器（ECD） 原理：监测溶液的电导率变化的检测器。 特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物。 ◆ 荧光检测器（FLD） 原理：某些溶质在紫外光激发后能发射可见光（荧光）的性质检测。 特点：选择性检测器、灵敏度高（10-12g）、对流量和温度敏感性低。　　　　　　　　　　　　　　　　　 3.4.3 检测器简介（三） ◆ 蒸发光散射检测器（ELSD） 原理：通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气（氮气）喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微小颗粒，被载气载带通过检测器。在检测器中，光被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。 特点：消除了溶剂的干扰，不受温度变化影响，灵敏度高，是通用型检测器。 4、色谱分析法简介 　　　液固色谱------以固体吸附剂为固定相，依靠吸附－脱附平衡实现分离，常用的固定相有碳酸钙、硅胶、三氧化二铝、氧化镁、活性炭等。 　　　特点：有时会发生不可逆吸附，应用受到限制。 　　　液液色谱------以吸附载带在惰性固相载体上的极性或非极性固定液为固定相，依靠溶解－解吸平衡实现分离。 　　　特点：固定液可选择余地大，重现性、分离效果好。 4.1.2　色谱法简介（二） 体积排阻色谱法--------以多孔性凝胶为固定相，借助多孔性凝胶孔径的大小，使样品中的大分子不能进入凝胶孔洞而完全被排阻，只能沿凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱，而首先被洗脱出来。被分析样品可按分子的相对大小分别先后流出。 　　　特点：洗脱时间短，但不适于分离组成复杂的混合物。 适用范围：分子量差别较大的样品。 离子对色谱法--------分析离子化的强极性化合物。 亲和色谱法等等 4.1.3 色谱法简介（三） ◆　键合相色谱法简介 键合相色谱-------是由液液色谱发展起来的，在高效液相色谱法中占有极其重要的地位。将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上，生成化学键合固定相，解决固定液的流失问题,是目前用的最多的一种色谱分析法。 根据键合固定相与流动相相对极性的强弱，分为正相键合相色谱法与反相键合相色谱法。 正相键合相色谱------固定相极性强； 反相键合相色谱------固定相极性弱。 ４.2.1 色谱柱简介（一） 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2）和氰基团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯甲烷等。 反相柱------固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。 4.2.2 色谱柱简介（二） 聚合物填料柱------通常为聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等. 优点：PH值为1—14均可