1.琼脂糖的质量.ppt

实 验 目 的 通过实验学习从血液中制备染色体DNA的方法。 学习琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度、DNA的构型、含量以及分子量的大小。 掌握DNA样品的纯化和定量检测方法。 实 验 原 理 红细胞裂解液裂解红细胞 细胞裂解液裂解白细胞 用蛋白酶K水解蛋白质 有机溶剂酚、氯仿抽提 在高盐条件下，用乙醇沉淀DNA 再用70%乙醇洗除沉淀中的盐分 即可获得染色体DNA 实 验 原 理 实 验 原 理 纯净的DNA A260/A280=1.8，制备的DNA样品应该为1.7~1.8 纯净的RNA A260/A280=2.0，制备的RNA样品应该大于2.0 如果制备的DNA样品A260/A2801.7，说明样品中含酶和蛋白质过高，应将样品用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA； A260/A2802，说明样品中RNA过高，可用RNase消化后，用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA； 如果样品A260/A280为1.8~2.0，说明样品中盐的含量过高，样品沉淀后应用70%乙醇多洗一遍。 提取的RNA样品A260/A280应大于1.80。RNA样品含有蛋白质会使A260/A280比值下降。 实 验 材 料 实 验 材 料 酚：氯仿：异戊醇（25：4：1） 70%乙醇 TE buffer RNAse 琼脂糖 TAE电泳缓冲液 电泳设备 紫外分光光度计 凝胶成像系统 染色体DNA的制备方法 1. 将800ul抗凝储冻血液置室温溶解。 2. 往管中加2ml红细胞裂解液，轻摇数次，置冰上15分钟，期间间歇摇动 几次，看管底沉淀，悬浮沉淀。 3. 6000rpm，室温离心10分钟，弃上清。 4. 往管中加入4ml红细胞裂解液，轻摇几次后，冰上5分钟，期间摇几次， 看管底沉淀，摇动试管悬浮沉淀。 5. 6000rpm，4℃离心5分钟，弃上清。 6. 重复步骤4、5，1-2遍（视红细胞洗净程度而定），至沉淀白色。 7. 用1×PBS 4ml洗涤所得沉淀，混匀，冰上5分钟，期间摇动几次。 8. 6000rpm，4℃离心5~10分钟，弃上清。 9. 每管中加入500μl白细胞裂解缓冲液，重悬细胞，加入20μl proteinase K（20mg/ml），混匀后置55℃水浴1小时，至溶液清亮（澄清）。 染色体DNA的制备方法 10. 用酚-氯仿（350μl+350μl）、氯仿（450μl）分别抽提一次，每次抽提后10000rpm，4℃离心5分钟，取上清（不要吸入有机相）。 11. 上清中加入2倍冰预冷无水乙醇和0.1倍3M NaAc。冰上20分钟或-20℃过夜。 12. 12000rpm，4℃离心10分钟，弃上清。 13. 用1ml 70%乙醇洗涤沉淀1-2次，12000rpm，4℃离心5分钟，弃上清。 14. 室温干燥沉淀5分钟。 15. 加入100μl DDW（无菌水），37℃水浴至DNA溶解。 16. 取样品10μl，用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定样品。 17. 相对完整的染色体DNA在电泳图中只出现一条分子量较大的条带，不会出现条带弥散现象。 18. 取样品10μl，稀释100倍，测A260和A280，计算DNA浓度。 琼脂糖凝胶电泳方 法 1.选择合适的电泳仪和水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平，检查稳压电源与正负极的线路。 2. 将电泳板置于制胶器中或用玻璃胶带封好制胶板两端，防止浇板时出现渗漏。选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳板负极的一端，使点样梳底部电泳板水平面的距离为0.5-1.0mm。 3. 制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。称取琼脂糖，溶解在电泳缓冲液中，大电泳槽约160毫升，小电泳槽约35毫升凝胶液，置微波炉或水浴锅中加热，至琼脂糖全部溶化。 4.待凝胶溶液冷至50℃左右时，在凝胶溶液中加入EB（终浓度0.5μg/ml），摇匀，轻轻倒入电泳板上，除去气泡。 琼脂糖凝胶电泳方 法 5．待凝胶冷却凝固后（约30分钟），在电泳槽内加入电泳缓冲液，大电泳槽约需1200ml，小电泳槽约180ml。从制胶器取出电泳板，放入电泳槽，然后小心取出点样梳，保持点样孔的完好，去除空内气泡。 6．待测的DNA样品中，加五分之一体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液（6×loading Buffer）。如果待测样品太小要用电泳缓冲液稀释，再加五分之一体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液。如点样体积10μl样品与2μl溴酚蓝指示剂点样缓冲液，混匀后小心地进行点样，记录点样顺序和点样量。 7．打开电源，DNA的迁移速度与电压成正比，与琼脂糖含量有关。最高电压不超过5V/cm(大电泳槽不超过200V，小电泳槽不超过150V)