细胞显微注射-中心-生物在线题库.docVIP

受精卵原核显微注射[实验目的]1 了解显微注射的基本原理2 掌握显微注射基本技术[实验原理]显微注射技术是利用显微操作系统和显微注射技术将外源目的基因直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到受体细胞的基因组内，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体动物的子宫内发育，从而获得转基因动物。它是目前基因转移效率较好的一种基因转移方法，可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移；外源基因的长度不受限制,可达100kb；实验周期相对比较短。由于显微注射技术直接对基因进行操作，整合率较高，因而是目前建立转基因动物极为重要的方法。 [仪器、材料和试剂]仪器和：PN-30拉针仪（Narishige） . OLYMPUS SZX7实体镜. EG-400磨针仪（Narishige） . MF-900 锻针仪（Narishige）OLYMPUS IX71倒置显微Narishige显微操作系统. JM-250电泳仪（大连捷迈） 眼科手术器械及显微手术器械（ROBOZ） . 毛细玻璃管G-100，GC-1（Narishige）细胞培养箱（Heraeus）、超净工作台、塑料平皿等。）试剂试剂细菌培养基 （1）LB培养基（1L）： NaCl 10g， 酵母提取物5g，蛋白胨10g ，pH7.0 （2）2×YT培养基(1L)：NaCl 5g， 酵母提取物10g，蛋白胨16g 质粒提取溶液配制 溶液Ⅰ：L-葡萄糖50mM，Tris-Cl(pH8.0) 25 mM，EDTA(pH8.0) 10mM，121.5℃ 高压灭菌20min。 溶液Ⅱ（100ml）：1N NaOH 20ul，10%SDS 10ml，水90ml现用现配。 溶液Ⅲ（100ml）：5mM乙酸甲60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml。 培养：培养M16(5.533g NaCl, 0.356g KCl, 0.252g CaCl2·2H2O, 0.162g KH2PO4, 0.293g MgSO4·7H2O, 2.101gNaHCO3, 2.610g Sodium lactate, 0.036g Sodium pyruvate, 1.00g Glucose, 4.00g BSA, 0.06g Penicillin G · potassium salt, 0.05g Streptomycin sulfate, 0.01g Phenol Red, 用三蒸水定容至1L)(5.533g NaCl, 0.356g KCl, 0.252g CaCl2·2H2O, 0.162g KH2PO4, 0.293g MgSO4·7H2O,0.349g NaHCO3, 4.969g HEPES, 2.610g Sodium lactate, 0.036g Sodium pyruvate, 1.00g Glucose, 4.00g BSA, 0.06g Penicillin G · potassium salt, 0.05g Streptomycin sulfate, 0.01g Phenol Red, 用三蒸水定容至1L)注射缓冲液（10mM tris-HCl pH7.4，0.1-0.25mM EDTA） （1）核酸提取组织裂解液：Tris·Cl (pH7.4) 25mM，EDTA 100mM，SDS 0.5%， protease K 100ug/ml. [方法与步骤]—3ug/ml，浓度高有助于提高目的基因的整 （1）根据所用的转基因载体特点，选择特定的限制性核酸内切酶将包含完整真核表达元件及目的基因的片段切下，进行琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕在紫外灯下将含目的转基因的片段的琼脂糖凝胶切下，操作时尽可能减少凝胶的体积。将所得凝胶块放入透析袋中，电泳2-3小时使凝胶中的DNA片段完全游离出凝胶并粘贴到透析袋壁上。去除透析袋中的凝胶块，将贴有DNA片段的透析袋放入到新鲜的电泳液中再电泳3-5分钟，收集袋中含DNA片段溶液。 （2）用Tris-HCl饱和酚抽提DNA溶液数次，以去除琼脂糖、蛋白等杂质，然后用乙醚抽提3次，留下层液体。 （3）用2倍体积无水乙醇沉淀2-3次， 70%乙醇洗2-3次，用2.4ml Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA溶解沉淀（至少需含5-10ug DNA），然后加入3g超纯CsCl，待其充分溶解后，检测其密度是否是1.70±0.01g/ml，如果有差异，可用CsCl或Tris/ EDTA缓冲液进行调整。 （4）将调整好密度的溶液转移到1.3cm×5.0cm超速离心管中，然后加几滴石蜡油封管，40000rpm室温离心48h（Bekman SW50.1转子），离心完毕，用针头在离心管底部扎孔收集管底约0.2ml组份，另外抽取离心管中部组份，用琼脂糖