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DC的制备方法 发布时间：2015-12-07 15:03 点击次数：665 【背景】DC 是「Dendritic Cells」的缩写，中文全称为「树突状细胞」，因其成熟时伸出 许多树突样或伪足样突起而得名。DC 是由 2011 年诺贝尔奖获得者、加拿大 籍科学家 Ralph M. Steinman 于 1973 年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞 (Antigen Presenting Cells, APC)。已证实，DC 是唯一能够显著刺激初始 T 细胞（Na?ve T cells）增殖的 APC，而其它种类的 APC（如单核巨噬细胞，B 细胞等）仅能刺激已活化 的或记忆性的 T 细胞，因此 DC 是机体适应性 T 细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中发挥着极其重要的作用。?【培养原理】因为 DC 需从其它种类细胞诱导分化而来，且可分为不同的成熟阶段，所以通常分为 2 个步骤进行培养：Step 1：从 DC 的祖细胞（如单核细胞）诱导分化为未成熟 DC（immature DC，iDC）；Step 2：从 iDC 诱导分化为成熟 DC（mature DC，mDC）。Step 1：GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）：GM-CSF 是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞集落的形成， 并具有促进早期红巨核细胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的功能。GM-CSF 是最早被鉴定 出对 DC 培养有作用的细胞因子之一。GM-CSF 在 DC 培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面 MHC II 类分子的表达得以提高，从而增强细胞的抗原递呈功能。此外，GM-CSF 也可促进 DC 的存活。IL-4（白细胞介素-4）IL-4 在由单核细胞诱导成 DC 的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从 而引导单核细胞向 DC 方向分化。 若培养体系中不加 IL-4，单核细胞将分化为巨噬细 胞。同时，IL-4 还有降低细胞表面表达 CD14 分子的能力。CD14 表达水平的降低是单 核细胞分化为 DC 的重要标志。GM-CSF 和 IL-4 共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟 DC，此时的 DC 具有较 强的抗原摄取和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达 MHC I 类、II 类 分子和 B7 家族分子（CD80, CD86 等），但不表达或低表达 CD14。Step 2：TNF-α/IL-1β/ IL-6（肿瘤坏死因子-α/白细胞介素-1β/白细胞介素-6）TNF-α，IL-1β和 IL-6 均为促炎症因子，在感染局部和肿瘤部位被诱导产生。体外 研究表明，这 3 种细胞因子均可下调未成熟 DC 的巨胞饮作用和表面 Fc 受体的表达， 使细胞内 MHC II 类分子区室(class II compartment)消失，但能够上调细胞表面 MHC I 类、II 类分子和 B7 家族分子(CD80, CD86 等)的表达， 使未成熟 DC 分化为成熟 DC， 此时 DC 的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强地激活 T 细胞。TNF-α/IL-1β/IL-6 三因子组合可在无牛血清培养条件下诱导 DC 的完全成熟，从而 制备出可以应用于临床的 DC。PGE2（prostaglandin E2，前列腺素 E2）PGE2 也是炎性介质，可由 TNF-α，IL-1 和 LPS（脂多糖）等炎症信号诱导产生。在?TNF-α/IL-1β/IL-6 成熟诱导组合中添加 PGE2，可进一步提高 DC 的产量、成熟度、迁 移能力和免疫激活能力。这里尤为重要的是 DC 迁移能力的提高。因为 TNF-α/IL-1β/IL-6 诱导成熟的 DC 迁 移能力较弱，不能很好地到达淋巴结而激活 T 细胞。而添加 PGE2 后诱导成熟的 DC 因 表面趋化因子受体的高表达，而更容易迁移至淋巴结，而引起机体对抗肿瘤的免疫反应。因此，TNF-α/IL-1β/IL-6/PGE2 组合(见下表)广泛应用于临床，并被认为是制备成熟 DC 的「金标准」? 组份 工作浓度 TNF-a 10ng/ml IL-1β 10ng/ml IL-6 1000 U/ml PGE2 1mg/ml 【注意事项】1.? DC 的来源：DC 有多种来源，包括外周血单核细胞（Monocyte）、脐带血 CD34+细胞、骨髓和胎 肝等，但因外周血单核细胞最容易获取、数量也最多，所以临床上被广泛用作 DC 的来源细胞。2.? DC 的成熟度：我们知道，DC 有未成熟和成熟两种状态，即 iDC 和 mDC，而 DC 的抗原递呈能力与其成