电泳技术.ppt

凝胶的制备过程： 1、 按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出。 2、 将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角。 3、 按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数。 4、 加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止。 5、 立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使成10°角，可减少液体泄漏的机会。 6、 室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1 X TBE缓冲液。 7、 小心取出梳子，加样。 核酸电泳指示剂的选择 指示剂： ? ?? ? 核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中 呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色，它在 1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似。 指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有： 1、 增加样 品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 2、 在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速度和位置。 3、 使样品呈色，使加样操作更方便。 染色剂： ? ?核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色。 ? ?溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min.琼脂 糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染 色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察。 　　银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色. 也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收。 电泳缓冲液 常用的有TAE、TPE及TBE TAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较 都是常用电泳缓冲液。三者相比： 1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化； 2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量； 3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%； 4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。 脉冲场凝胶电泳pulsed-field gel electrophoresis PFGE 超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长度（40kb）后DNA的迁移速率几乎与分子大小无关，而主要决定于电场强度。但 PEGE 解决了这一问题。 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。 该法可分离长至5Mb的DNA分子。严格说来，应叫交替电场凝胶电泳。 B+ A- +A -B 脉冲电场电泳示意图 A- +A B- +B 垂直交变电场系统 场翻转系统 箝位匀强电场系统 旋转胶系统 A- +A B- +B A- +A B- +B - + 蛋白质双向凝胶电泳 毛细管电泳 丙烯酰胺：3 ml TBE： 3 ml 水：9 ml AP：200 ul TEMED：20 ul 试验三 用于大分子分离的电泳技术 孔忠新 2009.11.06 电泳技术，是指在电场作用下，带电颗粒在由于所带的电荷不同以及分子大小差异而有不同的迁移行为从而彼此分离开来的一种实验技术。 电泳技术原理 许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子结构及所在介质的pH值和组成。由于混合物中各种组分所带电荷性质、电荷数量以及相对分子质量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速率也各异。因此，在一定时间内各组分移动的距离也不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。 电泳技术主要用于分离各种有机物（如氨基酸、多肽、蛋白质、脂类、核苷酸、核酸等）和无机盐；也可用于分析某种物质纯度，还可用于分子量