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细胞形态学检查 一、倒置显微镜观察细胞的形态 （一）一般的形态学观察： （二）用相差显微镜观察细胞的形态 （三）荧光显微镜观察细胞的形态和结构 Identification of cultured adult rat RGCs. Cultured cells were co-labeled with anti-Thy-1 antibody (A), anti-NF-L antibody (B), and DAPI (C). (D) A digitally merged image simultaneously represents all three fluorescent labels. (E) The corresponding phase-contrast image. 免疫荧光染色法 用于标记二抗体的荧光素： （1）异硫氰酸荧光素（FITC） 发射的荧光波长为490～619（绿色荧光） （2）四乙基罗丹明：荧光波长为540～660（橙红色荧光） （3）DAPI或Hoechst33258 : 染核，用紫外激发 免疫荧光的染色步骤 1、用95%乙醇固定细胞10-30 分或用冷丙酮固定5～10分。 2、用PBS洗3次。 3、用PBS配制的1‰Triton 10分。用PBS洗3次 4、用2%～5%BSA封闭2 小时 5、加入一抗过夜，PBS洗3次 6、加入二抗1～2小时， PBS洗3次 7、核复染，荧光显微镜观察。 正常细胞和组织的培养 一、上皮细胞培养(epithelial culture)上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。 体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2+含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。 表皮细胞培养 1、取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早产流产儿皮肤更好，取角化层薄者，切成0.5－1平方厘米小块。2、置0.02%EDTA中，室温，5分钟。3、换入0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。5、取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分钟。6、反复吹打，制成悬液。7、培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。8、直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2温箱培养。 神经胶质细胞培养 神经细胞（神经元〕不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性， 获取脑组织后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置Hanks液中漂洗一、二次。2、置于30—50倍体积的Hanks液中，此时脑组织比较柔软，反复吹打即制成细胞悬液。3、把悬液注入离心管室温中直立5—10分钟后，细胞或细胞团快自然下沉，脂肪等杂物易漂浮，可吸除上层、反复二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎块并获较多细胞成分。4、在沉降物中加入适量培养液，通过纱网过滤，计数并调整细胞密度。 5、接入培养瓶或皿中，置5%CO2温箱中培养。该细胞适应环境过程较长，接种后贴壁较慢。贴壁后短期内也可能不见细胞分裂现象，然而一旦生长后即能迅速进入旺盛的增殖状态。细胞传代可以0.25%胰酶消化处理。 大鼠肝细胞的培养(成年) 培养液: Koga 培养液, 最好加入Williams 和Waymouth MB752/1) 消化液:??型胶原酶300U/mg, 使用浓度为0.025% 方法: 1 灌流法分离肝细胞：门静脉和下腔插管静脉插管 2、用预灌流液(8.3 mg/ml NaCl,0.5 mg/ml KCl,2.4 mg/ml HEPES,pH 7.4)灌流8分钟 3、用含0.05%胶原酶的灌流液(预灌流液中加入5 mmol/LCaCl2, 0.05%胶原酶)继续灌流10分钟。 4、将肝叶剪下,将消化好的肝细胞轻轻刮下,获得的肝细胞悬液离心(600 r/min)三次,每次2分钟 5、然后重新悬浮