第二章结构生物学的研究方法.pptVIP

电子晶体学与电镜三维重构 电子晶体学与电镜三维重构 概况 电子显微镜的基本知识 电镜三维重构的理论基础 有关的实验技术 应用实例 概况 目前广泛使用的术语 方法特点 膜蛋白结构测定的困难 电子晶体学与X-射线晶体学的比较 电子晶体学的历史 结构测定的一般步骤 概况 目前广泛使用的术语： Electron crystallography 电子晶体学 Electron cryomicroscopy 低温电子显微学 3-dimensional reconstruction of electron microscopy 电镜三维重构 Electron diffraction and imaging 电子衍射和成像 概况 方法特点 分辨率：3~30 ?，大多数达不到原子分辨率 适用的样品：晶态或非晶态，复杂的大分子组装体 蛋白质的二维晶体 螺旋状分子复合物 纤维样品 单颗粒的大分子复合物（MW250kDa） 病毒 无相位问题，电镜像本身即包含振幅和位相信息 概况 膜蛋白结构测定的困难 PDB统计：内在膜蛋白 2003年3月 58 个 膜蛋白难于结晶 膜蛋白多是多重复合物，分子量大 概况 电子晶体学与X-射线晶体学的比较 X-ray EM 研究对象： 晶体 20um 微小晶体与薄膜，单颗粒，螺旋纤维 数据形式： 衍射数据 衍射数据，显微像 相位问题： 有 无 概况 电子晶体学的历史 20世纪30年代，原苏联的一个晶体学小组开始电子衍射的方法研究 1968年Klug和DeRosier开创电子显微镜三维重构的基本原理和方法重构了T4烟草花叶病毒颗粒尾部的三维空间结构。 1975年，Henderson和Unwin重构了细菌视紫红质（BR）的7?分辨率的三维结构。------电子晶体学的一个里程碑。 1982年，Klug因此获得诺贝尔化学奖。 1990年，Henderson等人把细菌视紫红质的研究提高到了3.5?分辨率，并提出了原子模型。 最近十几年来，电子晶体学已经发展成为一种X射线晶体学所不可替代的生物大分子空间结构分析的有效手段。 概况 结构测定的一般步骤 电镜样品的制备（包括蛋白质二维晶体的生长） 电镜观察照相 数据处理及计算机三维重构 （构建原子模型） 电子晶体学与电镜三维重构 概况 电子显微镜的基本知识 电镜三维重构的理论基础 有关的实验技术 应用实例 电子显微镜的基本知识 “科学之眼”的诞生 电子显微镜的分辨率 透射电镜的基本工作原理 “科学之眼”的诞生 光的衍射效应对分辨率的限制 d ? 0.4 l 人眼的分辨率：0.1~0.2 mm 光学显微镜：0.1~0.2 um 寻找新的光源 电子波动性的发现 1924 De. Broglie提出物质波理论，并被电子衍射实验证实 电子透镜的发现 1926年, H. Busch提出轴对称磁场可以汇聚电子束，并服从几何光学定律 第一台电子显微镜的研制 E. Ruska 电子显微镜的分辨率 电子的波长 电子的速度由加速电压决定，故电子的波长与加速电压有关： 　　　　　　 Ｅ（kv） l (?) ---------------------------------------- 50 0.0548 100 0.0388 200 0.0251 400 0.0164 1000