生物化学第4章蛋白质的共价结构37331幻灯片.pptVIP

第4章 蛋白质的共价结构 一、蛋白质通论 定氮法测定蛋白质含量 蛋白质的分类Ⅰ 蛋白质的分类Ⅱ 蛋白质的形状 蛋白质的大小Ⅰ 蛋白质的大小Ⅱ 蛋白质氨基酸残基数的估计 蛋白质结构的组织层次 蛋白质的一级结构 蛋白质的二级结构 蛋白质的三级结构 蛋白质的四级结构 蛋白质的一级结构决定高级结构 蛋白质功能的多样性 二、肽 肽的两端 肽的命名Ⅱ 肽的命名Ⅲ 肽基的C、O和N原子间的共振相互作用 肽键共振的结果Ⅰ 肽键共振的结果Ⅱ 肽基的顺、反构型 脯氨酸的亚氨基形成的肽键 肽的物理化学性质Ⅰ 肽的物理化学性质Ⅱ 双缩脲反应形成的络合物 双缩脲与肽的结构比较 三、蛋白质一级结构的测定 蛋白质测序的策略Ⅱ N末端分析Ⅰ N末端分析Ⅱ C末端分析Ⅰ 肼解法反应式 C末端分析Ⅱ C末端分析Ⅲ 二硫桥的断裂 还原法断裂二硫桥 氧化法断裂二硫桥 氨基酸组成的分析 某些氨基酸含量随水解时间的变化 氨基酸分析仪示意图 氨基酸分析仪示意图 氨基酸的离子交换柱层析图谱 多肽链的部分裂解 蛋白酶的专一性 溴化氰裂解法 肽段的分离纯化 氨基酸序列测定Ⅰ 串联质谱仪 串联质谱测序工作原理 氨基酸序列测定Ⅱ 肽段在多肽链中次序的决定 二硫桥位置的确定Ⅰ 对角线电泳 对角线电泳 二硫桥位置的确定Ⅱ 酰胺位置的确定 四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能 细胞色素C 细胞色素C的不变残基 不同物种细胞色素C的差异残基数 根据细胞色素C建立的系统树 氧合血红素蛋白质 氧合血红素蛋白的进化树 丝氨酸蛋白酶类 生物活性和来源差异很大的蛋白质 五、肽和蛋白质的人工合成 肽的人工合成（羧基的保护） 肽的人工合成（侧链上活泼基团的保护） 各种保护基团 现在最常用的氨基保护基团 羧基的叠氮法活化 羧基的活化酯法活化 羧基的混合酸酐法活化 碳二亚胺缩合剂 缩合剂催化的肽键形成 固相肽合成 固相肽合成图Ⅰ 固相肽合成图Ⅱ 分步合成的效率对最终产量的影响 哺乳类 鸟和爬虫类 硬骨鱼类 软骨鱼类 真菌 昆虫 两栖类 植物 肌肉中的氧合血红素蛋白质——肌红蛋白（Myoglobin）由一条肽链组成，含153个氨基酸残基，红细胞中的血红蛋白（Hemoglobin）是一个由两条α链（每条链141个氨基酸残基）和两条β链（每条链146个氨基酸残基）组成的四聚体蛋白。肌红蛋白、血红蛋白的α链和β链都是珠蛋白（globin），它们有很高的序列同源性，通过血红素结合氧的能力都被这3种多肽链保留下来了。 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶以及纤溶酶都是丝氨酸蛋白酶，它们有足够的序列同源性，在它们的活性中心都有丝氨酸，说明它们可能是由祖先丝氨酸蛋白酶进化而来。 卵清中的溶菌酶（含129个残基，水解细菌细胞壁的多糖成分）和人乳汁中的α-乳清蛋白（含123个残基，调节乳糖合成）功能和来源都很不相同，但它们有48个残基是相同的，三级结构也很相似，说明它们具有共同的蛋白质祖先。 肽的人工合成 最广泛应用的氨基保护基是苄氧甲酰基，它可以用催化加氢或用金属钠在液氨中处理去除。其它可以用作氨基保护基的还有三苯甲基、叔丁氧甲酰基、对甲苯磺酰基等，这些基团可以用HBr/CH3COOH在室温下除去。 （氨基的保护） 羧基一般用盐或酯的形式保护。盐是对羧基临时性的保护。酯有甲酯、乙酯、苄酯和叔丁酯等。甲酯和乙酯可用皂化法除去，但易引起消旋。苄酯可用H2/Pd法或金属钠－液氨法除去。叔丁酯可在温和条件下用酸除去。 侧链上需要保护的活泼基团有：Asp和Glu的β和γ羧基，Ser、Thr和Tyr的羟基，Cys的巯基，Lys的ε氨基，Arg的胍基等。这些保护基团有苄基、对甲苯磺酰基、甲基等。 Fmoc(9-fluorenyl-methoxycarbonyl)- 9-芴甲氧羰基 氯甲酸乙酯 叔胺 二硝基氟苯法（DNFB法）：用DNFB（Sanger试剂）与肽链N末端的氨基反应，生成DNP－多肽或DNP－蛋白质。然后水解肽链，分离得到DNP－氨基酸，纸层析、薄层层析或HPLC分离鉴定。 丹磺酰氯法（DNS法）：与DNFB法类似，由于丹磺酰氯有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍。 DNP-氨基酸 苯异硫氰酸酯法（Edman降解法）：肽链与PITC（Edman试剂）反应生成PTC－多肽（苯氨基硫甲酰多肽）或PTC－蛋白质，在酸性有机溶剂中加热时，N末端的PTC－氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物（PTH－氨基酸）并从肽链上脱落下来，除去N末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的。分离PTH－氨基酸并鉴定。肽链可用于鉴定下一个氨基酸，所以此法可以用于测序。 氨肽酶法：根据游离氨基酸出现的时间顺序分析N末端氨基酸。值得注意是不同的N末端氨基酸水解的速度不同，有时难以