RNA干扰.ppt

病毒性疾病的治疗：RNAi具有对抗侵入性遗传因子（如病毒、转座子、转基因）的作用、打破其复制循环、减弱或消除其基因毒性作用 。由于RNAi也存在于哺乳动物细胞中，RNAi或许可被利用来治疗病毒性疾病。 RNAi与人类免疫缺陷病毒 RNAi与肝炎病毒 RNAi与Rous肉瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒‥‥ 肿瘤的基因治疗：肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控异常的结果，传统技术诱发的单个癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一序列的dsRNA分子，只导入一种dsRNA 既可以产生多个基因同时沉默。 遗传性疾病的治疗：美国西北大学的Carthew R W和日本基因研究所的Ishizuka A等人发现RNAi与脆性X染色体综合征（与FMR-1基因异常有关的导致智力低下的染色体病）之间的关系密切，揭示了与RNAi相关机制的缺陷可能导致人类疾病的病理机制。遗传性疾病的RNAi治疗成为当今研究RNAi的又一大热点。 化学合成双链siRNA 设计合成单链DNA 转染 载体构建 效应检测 转染 mRNA水平和蛋白水平 筛选 查找文献； 查找靶基因mRNA； 利用网络在线支持，寻找siRNA序列； 根据目的选择实现RNAi的策略：载体法； 根据查找的siRNA序列，合成长链oligo； 构建载体； 转染； 检测效应（包括干扰效应和生物学效应） 2、/ ； 3、 or ； 1、检索文献，获取有实验证明的有效的靶点序列，并核对； /ssl-bin/app/rnai 支持accession number 或者序列直接输入 参数设计全面 输出经过筛选的candidate target （BLAST） 推荐★★★★★ /techlib/misc/siRNA_finder.html 最全面的RNA实验相关网站 有商品化的各类载体 获得siRNA target 需要手工BLAST 输出直接可递交公司合成的长链oligo 推荐 ★★★★ 一般应该从mRNA水平、蛋白质水平、细胞表型水平三个层次来检测干扰效率。 mRNA水平：RT-PCR、Real-time PCR； 蛋白质水平：Western-blot、ELISA、免疫组化； 细胞表型水平：MTT、克隆形成实验、流式细胞检测、细胞小室实验等。 PBK在乳腺癌中的功能研究 RT-PCR MTT实验 克隆形成实验 RT-PCR 克隆形成实验 MTT实验 control si-#3 RNAi是近年来才发现的一种古老的、保守的生物途径，是生物体适应外界环境、调控基因表达、防止外来遗传因子入侵的重要机制，具有重大的生物学意义。 RNA干扰被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。 随着对RNAi机制研究的深入和RNAi技术的不断完善，RNAi有望成为治疗各种疾病的新方法。 THANK YOU！ 常规化学合成siRNA为19nt + 3‘overhangs（2nt）的双链RNA，未 经修饰，如图所示。 Sense：正义链，RNA，序列与靶序列相同； Antisense：反义链，RNA，序列与靶序列互补； dTdT：两端悬垂，DNA，均在3端； 形式：双链，已退火； 优点：得到的siRNA纯度高并且无需进行任何其他实验，适用于已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量的siRNA进行研究。 缺点：合成价格高昂，不适用于筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素。 以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。 值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。 优点：价格便宜，试剂盒使用方便。适用于筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。 缺点：需要进行其他实验，且siRNA的合成量受到限制。不适用实验需要大量的，一个特定的siRNA进行长