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园艺植物抗寒基因工程研究进展 摘 要 低温是影响植物生长、发展、生存及分布的一个很重要的环境因子。植物在低温情况下一般会遭到不同程度的损伤, 每年由于低温引起的作物损失巨大, 人们寻找一种有效的方法来提高植物的抗寒性,抗寒基因工程的发展为防治园艺植物冻害提供了一条新途径。随着分子生物学技术的迅猛发展，寒害研究已经深入到分子水平，从而促进植物抗寒基因工程的发展。用基因工程的方法培育抗寒植物正以其周期短、见效快的优点而逐渐在植物遗传育种中占有重要地位。本文综述近年来植物转抗寒基因工程的主要进展，并讨论该领域以后的研究方向。 关键词：抗寒基因 同工酶 抗冻蛋白 转基因 超氧化物酶 一 抗寒基因的研究方法 潘杰、简令成等在诱导合成冬小麦抗寒特异性蛋白的实验中证实植物的抗寒性是一种累积性的数量性状，是由多基因控制的[1]。也就是说植物的抗寒性是由多种特异性的数量性的抗寒基因调控的。根据微效多基因假说，每一个抗寒基因对抗寒力性状的表现效应是微小的、积加的，且与环境作用难以区分。但随着分子生物学技术的发展，植物遗传标记的广为应用，识别、筛选、分离纯化和测序抗寒基因已经实现。 1.1 同工酶标记 1957 年，Markert和Moller首次提出同工酶的概念。同工酶的产生是由于生物进化过程中代谢的适应。Trunova证明低温锻炼后冬小麦过氧化物同工酶发生变化。从分子遗传学角度看，同工酶分子的编码、调控与基因活动的差异反映了基因型和表现型的相互关系，同工酶的研究把宏观的遗传现象联系到微观的分子水平[2]，从抗寒代谢过程认识到抗寒基因的存在和表达。 1.2 蛋白质标记 根据抗原抗体是否特异性结合来判断实验植物中的蛋白质是否同源，也可用单克隆抗体提取纯化特异性蛋白。Claudia、Kaye 等用单克隆抗体2H8、5A10 分别从菠菜蛋白质粗提物中分离纯化了低温适应蛋白CAP160、CAP853[3]。 1.3 DNA 分子标记 RFLP 标记：该法由Grodzicker 于1974 年创立。因为碱基的改变和染色体结构的改变会导致个体或种群DNA 片段酶切位点的改变，故若用限制性内切酶切割改变了的DNA 则产生长短、种类和数目不同的限制性片段。这些片段经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，在凝胶上呈现不同的带状分布，具有差异性的DNA 片段可通过Southern 杂交检测出来。若选择靶DNA，则通过Southern 转移到NC 或尼龙膜上，再利用探针进行Southern杂交后洗去多余探针， 经放射自显影得到靶DNA。RAPD 标记：1985 年，Mulis 首创了聚合酶链式反应PCR 技术。RAPD 是随机扩增多态性DNA的简称，是建立在PCR 基础上的DNA 分子标记技术。一般用一系列碱基的随机引物对所研究的基因DNA 进行PCR 扩增。扩增产物(DNA 片段)通过琼脂糖或聚丙烯凝胶电泳分离，经EB 染色后在紫外检测仪上检测扩增产物的多态性，从而对抗寒基因加以鉴定。 1.4 DNA 测序仪和基因数据库的应用 抗寒基因克隆通过自动测序仪测出其碱基组成和排序，并把其核苷酸序列与抗寒特异性蛋白的氨基酸序列加以比较，从而分析抗寒基因的表达情况。Jqaquin dina 等利用软件包PC/Gene6.5 分析了拟南芥CBF 抗寒基因族，认为CBF1、CBF2、CBF3 具有高度同源性，且它们表达时转录方向一致。通过比较氨基酸序列与所存于PROSTE 模式数据库的磷酸化位点还可推测抗寒蛋白的磷酸化位点，从而推测抗寒蛋白的功能。 二 抗寒相关基因及其抗寒机制 目前已知的植物抗寒相关基因主要为环境因素诱导表达的基因及某些组成型表达的基因, 后者如影响膜磷脂脂肪酸不饱和度的甘油一3一磷醋酞基转移酶基因。对一前者, 零上低温是诱导其表达的主要因素之一, 此外, 水分胁迫、脱落酸(A B A ) 处理等也能诱导这类基因的表达。 2.1环境因素诱导表达的植物抗寒相关基因的特点 人们在研究植物抗寒性时发现, 许多植物在抗寒锻炼过程中发生了一些生理变化, 出现了一些新的蛋白质及同工酶t’5 , 这表明低温诱导改变了某些基因的表达方式[4]。人们对此进行了较为深人的研究, 并由此克隆了一些编码这些特异蛋白的基因，这类基因通常称为冷诱导基因(Cold : nducible gene )。 三 抗寒功能研究 3. 1抗冻蛋白基因及其转基因园艺植物 自从北极鱼抗冻蛋白( Antifreeze proteins, AFPs)基因( AFP) 被揭示以后, 人们就尝试用转鱼类AFP的方法来提高作物