HPV技术问题解答.ppt

HPV核酸扩增分型检测项目常见问题分析凯普科技生物有限公司2006.12 目录 项目开展的要求 宫颈细胞样本的采集 宫颈细胞DNA的提取 PCR实验过程 导流杂交过程 结果判读 凯普HPV核酸扩增分型检测项目的开展要求 凯普HPV核酸扩增分型检测项目的开展要求 2.除了凯普医用核酸分子快速杂交仪外，凯普HPV核酸扩增分型检测项目在实验设备方面还需要哪些仪器设备？ 答： 标准型设置：按卫生部临检中心基因扩增实验室标准的实验室配置。在第4区（产物分析区）设置杂交仪和水浴锅做杂交分析。 经济型设置：分隔的房间（保证PCR产物的杂交不能污染到PCR前的实验过程）。PCR仪、至少2套微量移液器、超净工作台或生物安全柜、水浴锅/干热器、离心机、涡悬混匀器。 实验所需仪器 宫颈细胞样本的采集 1.在宫颈细胞采集过程中应该注意哪些问题？ A 不可在碘试验和醋酸试验之后采集样本。 B 检查前48小时内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等阴道内用药物。 C 检查前48小时最好不要行性生活。 D 月经期不可采集标本。 E 液基细胞学样本可以用于HPV检测。 F 注意避免交叉污染。 宫颈细胞样本的采集 2.样本采集中可否用棉拭子代替宫颈细胞采集刷？ 答：凯普宫颈细胞采集器及细胞保存系统对于采集足够的宫颈脱落细胞和长期保存细胞样本十分必要。 并且为了保证所采集细胞样本的质量，最好在采集细胞前先用棉拭子拭去宫颈口的分泌物。 不能保证避免用棉拭子采集的样本及其他缓冲液的保存条件对实验结果的不良影响。 宫颈细胞DNA的提取 宫颈细胞DNA的提取过程中常见问题有哪些？ 答： A 样品中有黏液性物质会导致离心时不能把细胞等固形物离心到管底。 可采取增大离心速度增长离心时间的方法使细胞离心到管底。或者用PBS或生理盐水洗涤一次后再离心。 B 丢弃上清时注意不要损失管底的沉淀。 C 在沉淀了DNA后，一定要在溶液挥发干净之后再溶解DNA。 D 注意避免交叉污染。 PCR实验过程 在PCR实验过程中要注意那些问题？ A 注意避免污染。 B 移液器尽量准确，避免由于加样过程中的损失造成试剂量的不足（主要是Taq酶）。每个试剂盒均有多加3人份，如果发现试剂不够请先校准所用移液器，同时避免多次吸取液体。 C PCR反应管要求使用200ul薄壁管。 D 注意试剂的有效期，避免反复冻融。 E 保证PCR仪正常工作。 导流杂交过程 1.在导流杂交实验过程中需要注意哪些？ A 保证加热仪器的温度在95℃以上，确保PCR产物的完全热变性。 B 变性后的PCR产物应该立即置于冰水中，避免在室温下暴露而使DNA复性。 C 在安装金属多孔板时，确保多孔板在卡槽内。否则会导致不能有效泵走液体。 D 分隔膜的多余孔位必须封住。也要确保杂交膜正确覆盖在分隔膜上。 E 每次清洗膜时，抽液干净。 F 确保实验用液体充分溶解并处于合适的温度。 G 注意杂交仪的保养。 结果分析及常见问题 结果分析及常见问题 结果分析及常见问题 2、IC点弱或者没有，但HPV分型阳性点显色正常。 可能原因： 由于IC和HPV DNA之间存在竞争，高浓度的HPV DNA可能会对IC点的扩增反应产生竞争性抑制。 如HPV分型点显色正常，则分型结果正确。 结果分析及常见问题 3、Biotin（生物素）点不显色 可能原因：①请确认所使用试剂是否仍在有 效期内。尤其是酶标液及显色 液是否按要求使用及储存。 ② 确定实验操作是否严格按照说 明书进行、且试剂是否按要求保 存使用。 结果分析及常见问题 4、阴性对照显现HPV分型阳性点 可能原因：①PCR试剂可能被污染，取5 ?l PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电 泳分析。 ②重复进行PCR及杂交试验 5、杂交膜有很高的背景 可能原因： ①可能由于封闭不足，使未结合 的酶标残留在膜上。确保封闭液 完全覆盖整个杂交膜。 ②