应用正交设计对大白菜纯度鉴定中EST―SSR反应体系的优化.docVIP

应用正交设计对大白菜纯度鉴定中EST―SSR反应体系的优化 　　摘 要：以3份大白菜杂交种及其亲本为试验材料，利用改良CTAB法提取基因组DNA，采用正交设计对Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA和Taq酶5因素4水平进行优化，结果表明，适用于大白菜纯度鉴定EST-SSR检测体系为：在10 μL反应体系中包含3.0 mmol?L-1 MgCl2、 400 μmol?L-1 dNTPs、0.20 μmol?L-1 SSR 引物、4 ng模板DNA和0.05 U Taq酶。利用该优化的体系，对3份大白菜杂交种进行单株育苗试验，每份杂交种取单株140株进行纯度鉴定。结果显示，扩增带型清晰、稳定，纯度检测结果与田间试验结果基本吻合，可用于大白菜种子纯度分子标记的进一步研究。 　　关键词：大白菜；纯度鉴定；正交设计；EST-SSR；优化 　　中图分类号：S634.1 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.03.001 　　大白菜（Brassica campestris L. ssp. pekinensis）是十字花科芸薹属 一年生草本植物，原产地中海沿岸和中国，栽培面积和消费量在中国居各类蔬菜之首。在大白菜杂交种生产与销售过程中，建立以质量检测为中心的良种繁殖与种子管理体系，对稳定和推广优良品种起着重要作用。目前，大白菜杂交种纯度鉴定直接可靠的方法是田间小区种植鉴定，但这一方法易受环境的影响，时间长，且费工占地。理想的种子纯度鉴定技术不但要准确可靠，还要简单、快速、经济、实用性强，这是种子纯度鉴定实现商业化的前提，也是该技术的发展趋势。近年来，植物分子生物学的迅猛发展使人们对作物的分析进入了分子水平，DNA分子标记技术因其能更有效地鉴别不同的甚至亲缘关系很近的基因型，在分析生物遗传多样性、构建品种指纹图谱和种子纯度鉴定等方面已成为更加理想的方法。 　　SSR（Simple Sequence Repeats）即简单序列重复，又称微卫星标记（microsatellite），是由少数几个核苷酸（一般为 1～6个）为重复单位组成的串联重复序列[1-2]。它广泛分布在真核生物的基因组中，并在两侧都有物种特异性的侧翼序列，鉴于基序的重复次数变化很大，因此，与其他DNA分子标记相比具有更高的多态性。由于其具有数量丰富、重复性好、可靠性高、呈共显性遗传、易于分析等特点，可用来高效、准确地检测生物体中的遗传变异。随着功能基因组学的迅速发展，GenBank中积累了许多重要物种的大量EST序列，这些序列获取简便，没有任何费用，已经成为发展SSR标记的重要来源，因此，基于表达序列标签（expressed sequence tags，EST）的微卫星（simple sequence repeats，SSR）标记技术不仅保留了SSR标记技术的所有优点，而且凸显了其便捷、花费低、效率高的优势[3-4]。 　　利用EST-SSR技术对植物基因组研究时应对该物种的EST-SSR反应体系进行优化，以建立一套适用于该物种的EST-SSR检测体系。目前，EST-SSR技术虽然已用于大白菜品种鉴定和种质资源分析的研究[5]，但有关大白菜纯度鉴定中EST-SSR检测体系及其优化方法的研究报道较少。本研究从PCR扩增的关键影响因素对EST-SSR体系进行优化，以建立一套稳定、准确的适用于大白菜纯度鉴定的EST-SSR检测体系，为大白菜种质资源研究、品种鉴定和遗传图谱构建等研究奠定基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 试验材料 　　试验材料为3份市售大白菜杂交种及其亲本，具体名称如表1所示。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 基因组DNA的提取 采用M. Somma等提出的CTAB法。每个品种随机挑取200粒均匀、饱满的种子，将其催芽，光照培养，待长出真叶后，采集幼嫩单株140株进行DNA提取。利用NanoDrop Spectrophotometer ND-1000核酸蛋白测定仪和1.5%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA浓度和质量，并将其稀释为50 ng?μL-1，-20 ℃保存备用。 　　1.2.2 EST-SSR位点选择 在前期研究基础上[4]，选择多态性较强的BC1位点作为优化的对象。该位点可对3份大白菜杂交种进行纯度鉴定，通过互为差异的特征谱带，寻找杂交种特征谱带带型为双亲互补带型的引物，确定引物BC1可以同时对3份大白菜杂交种进行纯度鉴定。位点信息及PCR引物序列详见表2。 　　1.2.3 SSR-PCR 反应体系的优化 以大白菜 2 号及其亲本为试验材料，选用已开发引物BC1，应用L16（ 45 ） 正交试验设计（表3）， 对Mg2+ 浓度、dNTP、引物浓度、模板浓度、Taq D