《大学化学教学课件》分子生物学研究法.pptVIP

基因文库构建示意图 RNA的基本操作技术 总RNA的提取 RNA提取注意事项： RNA电泳： 28S;18S;5S RNA纯度和浓度的测定 mRNA分离 最普遍的mRNA分离依赖于与真核生物mRNA3’端poly(A)互补的含有20-30胸腺嘧啶的oligo[dT]序列。通常将oligo[dT]链通过5’的磷酸键与纤维素基质连接，使用者可以通过其来分离纯化mRNA。 Ambion公司提供了几种Poly(A)Purist? mRNA Purification Kit试剂盒，这些试剂盒都是基于oligo[dT]-纤维素原理。 GE（Amersham Biosciences）公司也提供了几种利用oligo[dT]-纤维素柱子的mRNA纯化试剂盒。 BD生物科学公司和CLONTECH公司同样也提供了oligo[dT]- cellulose试剂盒。CLONTECH公司QIAGEN公司现利用了乳胶磁珠代替了纤维素与oligo[dT]共价连接。乳胶磁珠完美的球形表面能实现均一分布和最小的离心时间，产生纯化的mRNA。 cDNA的合成 cDNA第一链的合成 1.寡聚dT法：poly A tail 2.随机引物法： cDNA第二链的合成方法有以下2种: 1、自身引导法:合成的单链cDNA 3端能够形成一短的发夹结构，这就为第二链的合成提供了现成的引物，当第一链合成反应产物的DNA:RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段或反转录酶合成cDNA第二链，最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环，即可进一步克隆。目前很少使用。 2、置换合成法 该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链不用碱变性，而是在dNTP存在下，利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链的引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链。该反应有3个主要优点: (1) 非常有效； (2) 直接利用第一链反应产物，无须进一步处理和纯化； (3) 不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。　 细胞总mRNA ↓反转录酶 cDNA ↓ 插入合适载体 ↓ 转入受体菌 ↓ cDNA文库 cDNA文库的构建 在组织和培养的细胞中，一个细胞中有些mRNA可拥有数千个拷贝，而有些mRNA只有几个拷贝。根据mRNA分子含量的多寡，可以将mRNA划分为高丰度、中丰度和低丰度3种不同的类型。 从表中看出低丰度mRNA，其总量约占总mRNA的30%，约有11000个左右的不同种类的mRNA。如果获得11000个克隆，得到每一种低丰度mRNA的可能只有30％，因此，为了获得一个能够代表全部低丰度mRNA序列的cDNA基因文库，必须的最低克隆数(理论值)应是11000/0·30≈37000。 由于在实验中存在着取样差异，有些序列容易被克隆，有些序列不容易被克隆，为了保证cDNA文库中能够包含所有的序列，必须增加克隆的数目。为了使低丰度mRNA的cDNA克隆达到99%的期望率，需要筛选170000个克隆。 克隆基因的分离 1.应用核酸探针分离克隆目的基因: 把cDNA文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，就可以与特异性的核酸探针进行菌落杂交，以便筛选出具有目的基因的阳性克隆，这个过程叫作克隆基因的分离或筛选。 应用核酸探针分离目的基因的方法叫作核酸杂交筛选法。适用于大规模筛选。只要有合适的现成可用的核酸探针，就有可能从生物体的任何组织中分离到目的基因，也就能够有效地检测任何一种插入的外源DNA序列。 分离克隆基因的办法很多，根据不同的需要再去学习具体的方法，这里就不作一一介绍了。p177 β-半乳糖苷酶失活插入型载体：这种载体的基因组中含有大肠杆菌的lacZ区段，编码β-半乳糖苷酶。由这种载体感染大肠杆菌的lac-指示菌，涂布在补加有IPTG和X-gal的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑，但在克隆过程中，如果外源DNA插入到lac5区段上，阻断了β-半乳糖苷酶基因lacZ的编码序列，那么由这种重组体感染的lac-指示菌，由于不能合成β-半乳糖苷酶，只能形成无色的噬菌斑。 （蓝白斑筛选） 基因扩增 聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。 PCR技术的原理 首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三