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基因治疗 狭义：用正常的基因整合到细胞基因组以纠正和置换致病基因或用基因转移技术，二者不发生整合，也可短暂发挥作用，产生治疗效果。 治疗基因和靶细胞的选择 合适的载体将基因导入靶细胞 外源基因表达的体外筛选 靶细胞的回输 基因在体内表达，治疗疾病 目的基因的选择： 靶、细胞的选择：生殖细胞 体细胞 载体：病毒载体：逆转录病毒、 腺病毒及相关病载体 非病毒载体： 导入的方式：间接体内疗法（ex vivo） 体内疗法（in vivo） 治疗方案 1、基因矫正（gene correction）：将疾病基因的异常碱 基进行纠正，保留正常部分 2、基因置换（gene replacement）：体内基因同源重组 对体内疾病基因进行原位替换。 3、基因增补（gene augmentation）：常用 4、基因失活（gene inactivation）：阻断疾病基因的表达 去除疾病基因（基因敲除） 外源基因导入方法 成败的关键， 包括：病毒法 逆转录病毒载体 腺病毒载体 腺病毒及相关病毒载体 痘苗病毒载体 单纯疹病毒载体 理化方法 显微注射法 磷酸钙共沉淀 微粒攻击法 脂质体法 （一）逆转录病毒载体 1、逆转录病毒 原病毒：逆转录病毒的RNA经逆转录合成双链DNA整合到宿主细胞的染色体中，这种病毒DNA称原病毒。 2、逆转录病毒的生命周期 原病毒状态的建立 新病毒颗粒的装配和释出 3、逆转录病毒载体 Molonely小鼠白血病病毒载体（Mo-MLV）构建： 1）将gap，pol，env结构基因以外源基因取代 2）外源基因 待转移的治疗基因 标记基因 筛选用，多用Neo基因 3）两个外源基因可受一个启动子调控或分别受控于不同的启动子，双拷贝载体 4）保存病毒的包装信号 5）提高安全性，降低野生型的产生 优点： 1） 外源基因的长度，7kb 2）转移效率高 3）在宿主基因组稳定表达，并可传代 4）宿主范围广 5）安全 缺点： 1） 依赖于宿主DNA的复制 2）靶细胞有特殊的受体 3）应用包装细胞系 4）滴度低 （二）腺病毒载体（AV） DNA双链病毒，36kb 特点：宿主范围广，感染细胞时不整合到宿主基因组， 载体的构建采用同源重组， 原位感染静息期组织细胞，表达、时间长， 基因转移（in vivo） 优点：滴度高，可插入7~8kb的DNA片段，可用于体内 基因直接转移。 缺点：不能长期表达，在体内有复制的可能性。 （三）腺病毒相关载体（AAV） DNA单链线状病毒，5kb，含3个启动子rep、cap 基因的缺陷型病毒。 AAV载体的构建：以外源基因及其启动子序列取代rep、cap 基因，与包装质粒共转染入腺病毒感染的细胞。 特点：可定点整合，B19病毒整合在人19号染色体上， 耐热。 优点：1） 原病毒对人没有致病性 2）定点整合，减少了突变的可能性 3）能整合非分裂细胞 4）稳定表达 缺点：插入外源片段〈3.5kb，包装需噬菌体，滴度低 （四）痘苗病毒载体（VV） DNA病毒，基因组庞大 特点：容量大，25~40kb的外源基因 VV本身可较强的表达外源抗原 优点：容量大，MCS，可制备多价瘤苗，安全 缺点：有免疫原性 （五）单纯疹病毒载体（HSV） 特点：非分裂期细