2016-1-遗传的物质基础选编.ppt

* * 酵母：　Zymolyase裂解酶：　From Arthrobacter luteus（藤黄节杆菌） 　　　　Snailase　蜗牛酶： 霉菌：　用壳多糖酶Chitinase,　纤维素酶celluase 放线菌：溶解酶N0.2　resolvase, lytic enzyme. 由吞噬细胞所分泌，对革兰 阳性细菌敏感。 细菌：溶菌酶lysozyme,　又称胞壁质酶（muramidase） 或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase） 　 * 核酸 鉴定纯度 纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85） 纯RNA的A260/A280应为2.0。 若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低 核酸含量计算 A260=1.0, 相当于：50ug/mL双螺旋DNA 或：40ug/mL单链DNA（或RNA） 或：20ug/mL寡核苷酸 (增色与减色效应） * 2　RNA的制备 ★　RNase 的灭活： 玻璃器皿：140-200 ℃ ，8ｈ 塑料器皿：0.1%DEPC，37℃，过夜 提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍 反应体系中加RNasin等特异的RNase抑制剂 * 3 核酸的纯化 不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心可加以区分。 RNA＞DNA 变性DNA＞双链DNA ＞蛋白质， 变性程度越大，浮力密度越大 蛋白质：＜1.33g/ml DNA：1.71g/ml左右 RNA：＞1.89g/ml * 密度梯度超速离心测定核酸的浮力密度： 　8M CsCl，45000rpm，16h 　密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml 　平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力 　ρ = ρ0 + 4.2ω2（r2 - r02）× 10-10 　　ρ ：浮力密度 　　ω ：角速度（弧度/秒） 　　r：样品到转轴的距离 * 金建玲 高东 酵母菌呼吸缺陷型和 野生型线粒体DNA比较 山东大学学报(自然科学版) 1996 31(4):460-464. * 密度梯度超速离心测定DNA的G-C含量 G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系 ρ=0.1 XG-C + 1.658 XG-C = （ρ-1.658）× 10 注：5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度低于理论值。 * DNA测序技术 第一代测序技术：Sanger测序 第二代测序技术：高通量测序技术 * * * * * * * DNA序列质量监测 * * * * * * 高通量测序（NGS）的原理简介 高通量测序（High-Throughput Sequencing） 又称下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS），是相对于传统的桑格测序（Sanger Sequencing）而言的。 目前高通量测序的主要技术平台 罗氏公司(Roche)的454测序仪 Illumina公司的Solexa基因组分析仪 ABI的SOLID测序仪 * 高通量测序的特点 1 将目标DNA剪切为小片段 2 单个小片段DNA分子结合到固相表面 3 单分子独立扩增 4 每次只复制一个碱基（A,C,T,G）并检测信号 5 高分辨率的成像系统 * Solexa测序原理及实验流程 1.文库制备： 2.产生DNA簇 3.测序 4.数据分析 * 1.添加接头 利用物理方法将待测样品DNA打碎----几百个碱基（或更短）的小片段， 在DNA碎片两端加上接头(adapter) * 2.表面结合 Solexa的测序时利用微注射系统将已经加过接头和待测片断随机添加到玻璃Flow Cell内，每一个Flow Cell又补分成8条Lane(FIGURE1)，每条Lane的内表面上能与共价键的形式随机固定单链接头序列和带接头的单链待测DNA片断(2) * 3.桥型扩增循环获得多拷贝待测DNA片断。 在Flow cell内加入未被标记的dNTP和酶起始固相桥型扩增(3)。 所有单链桥型待测片段被扩增成双链桥片断，通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相 表面(4,5)。 通过不断循环，将会在Flow cell的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片断(6)。 * * * 4.测序。 加入DNA聚合酶和被荧光标记的dNTP 和接头引物进行扩增，在每一个测序列簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相