胡桃楸种仁壳黄酮二次纯化及体外抗氧化作用研究.docVIP

胡桃楸种仁壳黄酮二次纯化及体外抗氧化作用研究 　　摘要：利用HPD600大孔树脂二次纯化胡桃桃楸（JuglansmandshuricaMaxim.）种仁壳黄酮，并分析二次纯化黄酮的体外抗氧化作用。结果表明，纯化后黄酮纯度进一步提高到54.39%，二次纯化胡桃楸种仁壳黄酮表现出较好的清除ABTS、DPPH、羟自由基的能力和明显的脂质过氧化抑制作用，IC50值分别为9.52μg/mL，1.273、1.479、1.678mg/mL，呈现剂量一效应关系，且脂质过氧化抑制作用优于维生素C，可进一步开发成食品添加剂或功能性食品。 　　关键词：胡桃楸（JuglansmandshuricaMaxim.）；种仁壳；黄酮；抗氧化作用 　　中图分类号：TS255.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）09-2339-05 　　自由基是指含有孤立、不成对价电子的原子或原子基团。生物体在自然的新陈代谢过程中，会产生如超氧阴离子自由基（O2-?）、羟自由基（?OH）和过氧化氢（H2O2）等活性氧自由基。研究表明，哺乳动物的机体具有某些抵抗和减少氧化损伤的防御机制，但是由于活性氧自由基的高度活化，能够破坏脂类、蛋白质、酶类、DNA以及RNA等，所以当这些活性氧自由基过量产生而又不能被及时清除时，就会对机体造成极大的损害，甚至引发疾病。抗氧化物具有还原性，在反应过程中由于提供基团和氢原子而自身被氧化，因此发挥着自由基清除和氧化反应链阻断的作用，流行病学调查也显示含有抗氧化特性食物的摄入，特别是黄酮类和其他多酚化合物可提高机体的抗氧化功能，对人类的健康十分有益。 　　胡桃楸（JuglansmandshuricaMaxim.）已在民间和传统医药中用于治疗多种疾病，现代研究表明，胡桃楸具有抗氧化、镇痛抗炎、抗肿瘤、抗HIV等广泛的生物活性。胡桃楸种子是林业副产品，其种仁（俗称山核桃仁）营养价值很高。早已成为人们的食疗佳品。在种仁生产过程中，产生大量的种仁壳废弃物被丢弃，造成了资源的浪费。黄酮是具有酚羟基的一类还原性化合物，研究表明，黄酮具有抗氧化、保护心血管系统、抗肿瘤等多种生物活性。目前，关于胡桃楸种仁壳黄酮的体外抗氧化作用研究鲜见报道。 　　本研究是在前期胡桃楸种仁壳黄酮的提取工艺优化、大孔树脂纯化条件选择的基础上。进行二次纯化。并通过建立ABTS、DPPH、羟自由基和脂质过氧化等不同的氧化反应体系，分析二次纯化胡桃楸种仁壳黄酮的体外抗氧化作用，为胡桃楸种仁壳黄酮后续生物活性的深入研究奠定基础，为实现废弃胡桃楸种仁壳的综合利用和提高胡桃楸种子的附加值提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 　　胡桃楸种仁壳一次纯化黄酮：采用超声波辅助提取。HPD-600大孔树脂纯化。45℃减压浓缩，4℃保存。DPPH、ABTS、大豆卵磷脂（Phosphatidvl-choline）、二甲基亚砜（DMSO），购于Sigma公司；Trolox，购于Merck公司：维生素C，国药集团化学试剂有限公司。其他试剂均为分析纯。 　　1.2仪器 　　G560E型旋涡混合器，美国Scientificindustries公司：5804R型离心机，德国Eppendorf公司：UV-2450型紫外分光光度计，日本岛津公司：InfinireM200PRO型全波长酶标仪，瑞士TECAN公司。 　　1.3 方法 　　1.3.1 胡桃楸种仁壳黄酮二次纯化 将胡桃楸种仁壳黄酮一次纯化液调成质量浓度为1.2mg/mL的溶液，动态上样，控制流速1mL/min。先用4BV的蒸馏水洗树脂柱，然后用40%乙醇溶液洗脱，控制洗脱流速2mL/min，洗脱液分段收集：再用60%的乙醇溶液洗脱，洗脱液分段收集，测定每份洗脱液中黄酮的浓度，计算黄酮回收率。 　　1.3.2 黄酮纯度测定 称取纯化后各段产品冻干粉溶于60%乙醇溶液中，采用NaNO2-A1（NO3）3比色法测定溶液的黄酮浓度，按公式（1）计算纯度，并进行比较。 　　（1） 　　式中，C为黄酮质量浓度（mg/mL），N为稀释倍数，y为样品液体积（mL），m为样品质量（mg）。 　　1.3.3 总还原力测定 测定大孔树脂纯化后各段产品的总还原力，并进行比较。采用铁氰化钾还原法，在试管中加入提取液2mL，再分别加入pH6.6的磷酸缓冲液2.5mL、1%铁氰化钾2.5mL，混匀后密封50℃水浴20min，然后冰浴急速冷却，再加入10%的三氯乙酸2.5mL，混匀，4000r/min离心10min。取上清液2.5mL。加入2.5mL蒸馏水，再加入0.5mL三氯化铁显色，静置10min，700nm波长处测定其吸光度A1。以蒸馏水代替提取液的吸光度为A0。Fe3+总还原力=A1-A0，A1-A0越大