血清多肽组及其个体差异的纳升液相色谱―高分辨串联质谱分析.docVIP

血清多肽组及其个体差异的纳升液相色谱―高分辨串联质谱分析 　　摘 要 分析和比较疾病组及健康对照组的混合样品是血清多肽组生物标记物研究的常用方法，但对健康个体多肽组的差异和共性关注较少。本研究利用纳升液相色谱.高分辨四级杆飞行时间质谱鉴定健康人混合血清样品（20例）的多肽组，阐明血清多肽组的分子量分布等一般特征，进而选取6例个体样品单独分析并与混合样品的分析结果进行比较，说明正常健康样品之间的个体差异和共同成分。结果表明，可鉴定序列的血清多肽组的分子量范围在7000 Da以下，纤维蛋白原α链等蛋白质所属肽段的检出频率最高，肽段在蛋白质水平上分布具有不均一性，排在前10%的蛋白质占据了约50%的总肽段，而后40%的蛋白质只有1条检出肽段。此外，在所有样品中都检测到了来自于8个蛋白质的12个共同肽段，检测到了N端乙酰化、氨基酸氧化、磷酸化、脱氨化和脱水等翻译后修饰和明显的阶梯序列现象。本研究在肽段序列水平分析了血清多肽组的基本特征和个体差异，可为血清多肽组生物标志物研究提供参考。 　　关键词 多肽组； 高分辨飞行时间质谱； 血清； 个体差异 　　1 引 言 　　生物体内的内源性多肽为蛋白质降解的产物，反映了蛋白质的降解过程，有些多肽还具有抗菌抗炎和信号传导等作用[1]。多肽组学的概念最早出现于2001年，是指生物样品中的全部肽段，生物标记物和神经活性肽研究是多肽组学的两个最主要应用[2]。生物标记物的一个主要来源是血液，随着蛋白质组学技术的完善和拓展，血清多肽组已成为基于质谱的血液生物标记物研究的重要方法。 　　基质辅助激光解吸电离.飞行时间质谱（MALDI.TOF）和纳升液相色谱.电喷雾串联质谱是进行多肽组研究的两种常用技术，但它们取得的多肽组数据及应用模式不同。MALDI.TOF方法检测的是肽段分子量，在多肽组中也称为谱图轮廓（Spectra profile）[3～5]。利用MALDI.TOF方法筛选生物标记物首先需要在疾病组与对照组中找到相同分子量的质谱峰，然后比较它们离子强度的差异 [6，7]，本方法的优势在于简单、直观、质量检测范围较宽，并且MALDI源与傅里叶变换离子回旋共振质谱或串联飞行时间质谱（TOF/TOF）联用也可以获得序列信息[8，9]。但是，在MALDI.TOF/TOF仪器中非酶切肽段的断裂效率通常不够充分，此外，使用MALDI源质谱获得的多肽组的体量相对较小，这可能与MALDI.TOF仪器较少与液相色谱联用和MALDI源中的电离抑制作用有关，例如，即使对于蛋白质标准品的酶切产物也较难检测到全部的酶切肽段[10]。利用纳升液相色谱―串联质谱技术则不仅显著增加了肽段鉴定能力和数目，也可以与标记或非标记技术联用实现相对定量[11，12]，但是，尽管该技术拓展了血清多肽组的范围，在应用模式上同样为比较疾病组和健康对照组的混合样品，对个体差异重视不够，目前，尚未有关健康个体样品血清多肽组差异程度的报道。 　　本研究利用氧化石墨烯.磷酸镧纳米磁性复合材料（LaGM）分离和富集血液多肽[13]，利用纳升液相色谱.高分辨串联质谱（Nano LC.TripleTOFTM 5600）首先分析健康人的混合血清样本，确定多肽组的分子量范围、肽段分布和磷酸化等翻译后修饰特征，然后对比分析另外6个健康个体的血清样品，探讨血清多肽组的个体差异和共性。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　Eksigent nanoLC.UltraTM 2D 系统、TripleTOF 5600+高分辨质谱仪、Protein Pilot 4.5软件（AB SCIEX）； 真空冷冻干燥机（Thermo Savant）。 　　氧化石墨烯.磷酸镧纳米磁性复合材料，纳升液相色谱流动相 A为0.1% 甲酸.2% 乙腈，流动相 B为0.1% 甲酸.98% 乙腈，C 18反相色谱捕集柱、C 18反相色谱分析柱。 　　2.2 多肽的分离和富集 　　30 μL人血清样品溶解于 500 μL去离子水，与20 μL 30 mg/mL LaGM 复合材料混合，在冰水浴中涡旋2 min，1000 r/min振荡10 min。1000 r/min离心5 min，磁分离，在沉淀物中加入500 μL 水，涡旋1 min，振荡5 min，磁分离，去掉上层清液，重复2次。在沉淀中加入20 μL 80%乙腈+1% 三氟乙酸的洗脱液，涡旋1 min，振荡5 min，磁分离，收集上层清液并冷冻干燥。 　　2.3 反相色谱.TripleTOF质谱分析 　　将分离冻干的多肽样品溶解于Nano.RPLC Buffer A中，在线Nano.RPLC液相色谱在Eksigent nanoLC.UltraTM 2D系统（AB SCIEX）进行，溶解后的样品以2 μL