WT-1基因在肾胚瘤中表达及其对G401细胞系肿瘤逆转的研究.pdf

WT一1基因在肾胚瘤中的表达及其 对G401细胞系肿瘤逆转的研究 中文摘要 前 言 肾胚瘤是一种较常见的儿科实体肿瘤，诊断年龄平均为15个月，其中 1—5岁者占75％，而90％见于7岁以前。该肿瘤的遗传学基础比较复杂， 现已发现有多个染色体位点与其发生有关，其一是定位于染色体1lpl3的 抑癌基因一WT一1，据统计约5—25％的肾胚瘤发生WT一1基因的改变，现 在认为wT—l蛋白在细胞增殖、分化及凋亡等方面均有一定作用。现在对 于肾胚瘤的治疗主要为放疗、化疗或肾脏切除，但由于肾胚瘤的发病年龄 早，放化疗所造成的方法副作用比成年人更大，所以有待寻找一条更为安全 有效的治疗途径。 目 的 本实验拟检测wT一1基因在肾胚瘤各细胞中的表达情况，然后根据对 WT—l和EGR—I基因在肾胚瘤中表达情况的统计分析，探讨其在肿瘤发 因连到表达载体导入肾胚瘤细胞系G401中表达，分子水平研究G401细胞 的生长、凋亡及肿瘤逆转情况，从而为研究wT，基因的功能提供参考，为基 因水平治疗肾胚瘤提供重要的依据。 方 法 (1)采用免疫组化法检测61例肾胚瘤石蜡标本上皮细胞、胚基细胞、 ·1· 间质细胞wT一1和EGR—I基因的表达情况，然后通过单人进行半定量估 包确定wT一1和EGR—I的表达与病理阶段之间的关系，通过X2检验及 Kendallg相关分析研究wT一1和EGR—I表达的相关性o cDNA文库转入 (2)提纯胎肾mRNA进行RT—PCR扩增，将WT一1 位杂交，筛选所需克隆。 (3)利用质粒提取试剂盒提取原位杂交呈阳性的克隆的重组质粒 DNA，再经限制性内切酶酶切及纯化，将其与表达载体连接，利用脂质体介 导法将wr一1基因导入肾胚瘤G401细胞系，用流氏细胞仪和电泳方法检 blot法检测wr一1蛋白的表达情况。 测细胞凋亡情况，用Western 结 果 (1)免疫组化结果表明WT一1蛋白定位于细胞核内，正常肾脏肾小球 内皮细胞核染色较深，而肾小管核染色较浅。6l例肾胚瘤样品中有36 (59％)例的胚基细胞呈阳性；而EGR—I蛋白定位于细胞质，正常肾脏的 近曲小管和远曲小管EGR—I免疫组化胞质染色均较深，而肾小球染色较 浅。肾胚瘤的胚基、上皮、间质成分均可发生EGR—I免疫反应。6l例肾 胚瘤样品中有56％样品胚基发生EGR—I免疫反应，87％样品的上皮细胞 发生免疫反应，但间质细胞EGR—I表达较少。与WT一1基因相比，EGR —I基因表达更广泛，而且染色更深，胚基表达EGR—I蛋白水平与病理 阶段相关，统计分析表明胚基中wT一1和EGR—I的表达明显相关。 产物，此序列为WT一1基因C一末端锌指区的一段。我们将购买的人胎肾 筛选可见有转化成功的白色菌落，出现白斑比率为85％，利用RT二PCR扩 增产物作为wr一1基因eDNA探针对阳性菌落进行原位杂交，结果在4个 菌落中均出现放射自显影阳性结果。 (3)提纯原位杂交筛选出的阳性菌落重组质粒DNA，并进行Ecom和 NotI酶切，电泳结果显示载体上有两个插入片段，其一约0．8kb，其二约1． ·2· 5kb。我们回收了大片段，将其连接到表达载体，然后导入肾胚瘤G401细 胞系，经药物筛选得到阳性克隆。应用流式细胞仪分析细胞凋亡情况，结果 后细胞中有WT一1基因表达，而在未导人此基因的细胞中没有WT一1基 因的表达j 讨 论 (1)本研究结果表明，在肾胚瘤的胚基细胞和上皮细胞中均有较高水 平的WT一1和EGR—I的表达，而在问质成分中表达水平较低。这些结果 表明肾胚瘤发生的分子基础有一定区别，闻质成分为主的肿瘤可能wr—l 基因的表达完全缺失。这说明wT一1和EGR