玉屏风散对猪瘟抗体影响.doc

玉屏风散超微粉对猪瘟抗体水平影响研究 1材料和方法 1.1实验材料和仪器 1.1.1实验材料 中药材：黄芪、白术、防风先单个粗粉和超微粉碎，粗粉细度为60目，超微粉碎细度为300目，粉碎完后按2：2：1比例混合均匀。 疫苗：猪瘟细胞苗为成都中牧股份有限公司生产。 试剂：均为分析纯。 1.1.2实验仪器 冷冻高速离心机（Beckman），MEDOL 550型酶标仪（美国BIO-RAD公司），RT-3000全自动洗板机（雷杜公司）。 1.1.3实验动物 四川犍为荣兴猪场三元杂交（D×L×Y）同品种、同日龄断奶仔猪50头，随机平均分成五组，每组10头。 1.2实验方法 1.2.1基础日粮 试验用基础日粮由四川巨星饲料有限公司提供，饲料营养水平详见表5。 表5 营养水平 Table5 Nutrients level 营养水平 Ⅰ组 Ⅱ组 Ⅲ组 Ⅳ组 Ⅴ组 DE(MJ/Kg) 16.82 16.82 16.82 16.82 16.82 CP(%) 21.32 21.32 21.32 21.32 21.32 Ca(%) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 P(%) 0.79 0.79 0.79 0.79 0.79 Met(%) 0.36 0.36 0.36 0.36 0.36 Thr(%) 0.86 0.86 0.86 0.86 0.86 Lys(%) 1.24 1.24 1.24 1.24 1.24 1.2.2分组及给药 试验采用单因素完全随机试验设计，分为5个组，每组10只，将分好组的试验用猪按表6进行试验，试验共30天。 表6 试验设计 Table6 Experiment design 组别 试验方案 Ⅰ组 基础日粮+1%玉屏风散超微粉+2头份猪瘟细胞苗/头 Ⅱ组 基础日粮+0.5%玉屏风散超微粉+2头份猪瘟细胞苗/头 Ⅲ组 基础日粮+0.1%玉屏风散超微粉+2头份猪瘟细胞苗/头 Ⅳ组 基础日粮+2%玉屏风散粗粉+2头份猪瘟细胞苗/头 Ⅴ组 基础日粮+2头份猪瘟细胞苗/头 1.2.3饲养方式 各组试验动物在同一条件下进行饲养，利用同一朝向的同一栋猪舍。环境温度、环境湿度等控制一致，试验前对猪舍进行统一清洗、消毒，严格按照“全进全出”的原则。试验动物自由采食和饮水，并进行专人饲养管理。 1.2.4样品的制备 试验后的7d、14d、21d、28d每组随机抽取5头猪从前腔静脉采血1-2mL, 置37℃恒温箱中1-5h后，在4℃冰箱中放置2h，经1500r/min 离心5min，取出血清置-20℃保存备用。 1.2.5猪瘟抗体检测 1.2.5.1稀释 待检血清将100μl稀释液（1倍PBS）加入反应孔中，然后向相应的孔中加入待检测血清、标准阳性血清和标准阴性血清各2μl，标准阳性血清和阴性血清各加2孔，37℃湿盒作用2h。 1.2.5.2洗涤 将孔中的液体用力甩净，每孔加入300μl 洗液(PBST),室温震荡洗涤3min，如此洗涤3次,最后一次拍打干净。 1.2.5.3加入猪IgG 酶标抗体 将试剂盒配备的辣根过氧化氢酶标记的兔抗猪IgG用稀释液(1 倍PBS)以1:5000 稀释，充分混合均匀。用多道移液器加入到各反应孔中，100μl/孔。37℃湿盒作用45min。 1.2.5.4洗涤 重复操作上一次洗涤步骤，洗涤3 次，最后一次拍干。 1.2.5.5加入TMB 底物和0.75%过氧化氢尿素 临用前将底物作用液A:B以1:50稀释，混匀后加入0.75%过氧化氢尿素(按1.8μl/mlAB 混合液)，用多道移液器加入到各反应孔中，100μl/孔。避光作用5min。 1.2.5.6加入终止液 用多道移液器将终止液(2mol/LH2SO4)加入到各反应孔中，50μl/孔。注意要按加酶标二抗的顺序加终止液。应用酶标仪，在490nm波长处测定样本的OD值。 1.2.6统计分析 本试验数据采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析，试验结果用平均数±标准误差表示，采用Duncan多重比较进行显著性分析。 2.结果和分析 各组动物免疫后不同时期CSF抗体值见表7，各组免疫抗体水平比较见图9. 表7 各组动物免疫后不同时期CSF抗体值 Table7 CSF antibody value during different periods after each animal immune 组别 免疫后天数 7d 14d 21d 28d V组 0.451±0.085a 0.541±0.059 a 0.765±0.027 a 0.741±0.035 a I组 0.514±0.012 b 0.696±0.085 b 0.