生物大分子相互作用新技术教材.ppt

用供体的激发波长的光照射样品,没有共振转移时，只检测到供体的荧光，发生共振转移时，供体的荧光减弱，受体被激发出现荧光 FRET已被广泛应用于生物医学及各个相关领域,包括药学,遗传学,材料学科等。从应用研究的内容上主要是围绕生物大分子,针对空间结构,功能及其生物大分子相互作用等。利用FRET 的高分辨率结合GFP 在细胞内活体定位等有所发展。3. 1 　在生物大分子空间结构研究中的应用 FRET已被用于以分子水平观察生物大分子。如蛋白质、DNA , RNA 等的空间结构及其变化。Hillisch A[2 ]等通过对核酸分子荧光标记的精确定位,进行了蛋白质DNA 复合物的结构研究; TricerriMA[3 ] 等通过利用荧光探针ALEXA - 488 或ALEXA - 546 标记半胱氨酸突变体,成功地解决了在载脂蛋白A - I 中的高密脂肪蛋白(HDL) 与磷脂结合的空间结构问题,作为X 射线晶体结构分析的有益补充。还有人将FRET用于RNA 构象变化的动力学研究,以及药物分子对肌动蛋白结构的影响等。3. 2 　生物大分子功能研究中的应用 FRET在被用于大分子的结构和功能作用及功能的调节机制之中。Pearce LL[4 ]等通过构造由两侧有GFP 突变体的金属硫蛋白融合体,观察在内源性(nitric oxide ,NO) 产生时FRET 的变化,揭示了金属硫蛋白在NO 信号通道中的作用。Hampel KJ 与Burke JM[5 ]研究了核酶中loop E - like 序列构想改变对催化作用的影响。Johnson D A[6 ]等人曾以5 - 异硫氰基荧光素为D 标记肌动蛋白,以AMS 为A 标记肌钙蛋白,当二者重新组合成肌丝时,荧光基团之间会发生能量转移。而Ca2 + 的加入会影响总荧光强度,从中显示了Ca2 + 的调节作用。3. 3 　在生物大分子相互作用中的应用 FRET应用于蛋白质分子间的作用,免疫分析和核酸杂交。使用FRET来检测蛋白质大分子与其他 原子的相互作用,将两蛋白质分别使用CFP/ YFP(或BFP/ GFP) 标记,当两者在同一细胞表达时,只要检测到FRET发生,则证明两蛋白间距离小于100 nm ,存在相互作用[7 ] 。此方案已被成功地用来验证了CFP - 钙调蛋白与M13 - YFP 融合蛋白间的相互作用。同时,在细胞凋亡的研究中,使用BFP 和GFP分别标记Bcl - 2 和Bax ,记录到了两者的时空相互 作用。3. 4 　在生物大分子细胞内定位研究的应用 GFP 是研究活体细胞内空间定位的首要工具。功能蛋白质分子不会因为融合GFP 而影响其原有功能,因此,可以利用FRET 对蛋白质作用的整个生理过程发生部位进行活细胞体内观察,并且这种观察是实时动态的 Biacore 技术也是一种重要的研究生物大分子相互作用的研究手段。BIA是英语”Biomolecular Interaction Analysis” 的缩写，Biacore提供了实时观察生物分子间相互作用的技术。通过它能观察两种分子结合的特异性，能知道两种分子的结合有多强，还能了解生物分子的结合过程共有多少个协同者和参与者。Biacore可以让您得到用其他技术方法难以得到的结果，因为它可以实时反映分子结合过程中每一秒变化的情况。无需借助标记物进行分析使Biacore广泛应用于各类生物体系的测定，从各类小分子化合物、多肽、蛋白质、寡核苷酸和寡聚糖直至类脂、噬菌体、病毒和细胞。Biacore是基于表面等离子共振（SPR）技术来实时跟踪生物分子间的相互作用，而不用任何标记物。实验时先将一种生物分子固定在传感器芯片表面，将与之相互作用的分子溶于溶液流过芯片表面。检测器能跟踪检测溶液中的分子与芯片表面的分子结合、解离整个过程的变化。BIAcore系统的3个核心部分是传感器芯片，SPR光学检测系统，微射流卡盘 简单说来就是通过蛋白质与蛋白质的作用来研究自己感兴趣的DNA。更详细的在连接里，还有一个简单的示意图！：） 表面等离子体波共振(SPR)现象是一种光波与金属电子相互作用引起的光电子现象。表面等离子共振（SPR）是一种物理现象，当入射光以临界角入射到两种不同折射率的介质界面（比如玻璃表面的金或银镀层）时，可引起金属自由电子的共振，由于电子吸收了光能量，从而使反射光在一定角度内大大减弱。其中，使反射光在一定角度内完全消失的入射角称为SPR角。SPR随表面折射率的变化而变化，而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比。因此可以通过获取生物反应过程中SPR角的动态变化，得到生物分子之间相互作用的特异性信号。 SPR is traditionally utilized in this “angle-scanning” mode. Ad