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实验四 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达及鉴定 石陆娥 短号 663605 QQ 【实验目的】 1.了解外源基因在原核细胞中表达的基础理论。 2.了解包涵体鉴定方法 3.了解表达产物鉴定的方法 【实验原理】 1.外源基因在原核细胞中的表达 蛋白质通常是研究的最终目标，因此蛋白质的表达在发酵工程中占有非常重要的地位。常用的表达系统有原核细胞和真核细胞。 原核细胞表达系统主要使用大肠杆菌，真核细胞表达系统主要有酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。这些表达系统各有优缺点，应根据实验目的和实验室条件加以选择。 本实验主要介绍以大肠杆菌为代表的原核细胞表达系统。 （1）大肠杆菌表达系统的特点： 生物学特性和遗传背景清楚，易于操作； 已开发较多的克隆载体可供选择； 容易获得大量的外源蛋白（外源蛋白可占细菌总蛋白50％左右）。 （2）蛋白质在原核细胞中的表达特点： 原核细胞有其固有的RNA聚合酶，识别原核基因的启动子。 原核基因的mRNA含有SD序列，启动蛋白质的合成。 原核细胞没有mRNA转录后加工的能力。因此，在原核细胞中表达真核基因时，应使用cDNA为目的基因。?????? （2）蛋白质在原核细胞中的表达特点 外源基因在大肠杆菌中高效表达时，表达产物往往在胞浆聚集，形成均一密度的包涵体。 包涵体的形成有利于保护表达产物不被胞内的蛋白酶降解，而且可以通过包涵体和胞内其他蛋白质密度不同来纯化包涵体蛋白。 但包涵体蛋白不具有该蛋白的所有生物学活性，往往需要通过变性复性的方法恢复活性，有时只能回复部分活性。 （3）蛋白质在原核细胞表达的调控 启动子是转录水平调控的主要因素。 根据启动子起始mRNA合成效率的不同，可分为强、弱启动子，但是启动子的强弱是相对于不同基因而言的。 有些启动子的活性可以通过物理或化学的方法诱导调控。 在基因工程中，原核表达系统通常采用可调控的强启动子。 常用的原核启动子有：由异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导的lac启动子，由3-吲哚乙酸（IAA）诱导的trp启动子，由温度诱导的PL和PR启动子等。  （4）蛋白质在原核细胞中的表达形式 非融合蛋白 融合蛋白 分泌型蛋白 非融合蛋白 非融合蛋白使用的外源基因必须具有从起始密码子到终止密码子的完整读框。非融合蛋白的一级结构和天然蛋白质相同，是一些体内应用基因工程产品的必要条件。 但是非融合蛋白在原核细胞内不稳定，易被降解，而且不易纯化。 融合蛋白 融合蛋白指的是在表达产物的N端或C端具有非目的蛋白的氨基酸残基。 融合蛋白使用的外源基因，必须注意其阅读框和载体上原核阅读框相符和。 融合蛋白在大肠杆菌内较稳定，不易被降解。而且，作为融合蛋白一部分的原核多肽往往是用于纯化，或是作为检测该融合蛋白的“标签（tag）”。 如本实验中采用金属螯合亲和层析技术纯化带6个His标签的融合蛋白。 分泌型表达 分泌型表达指的是在细胞浆内合成的多肽进入内膜和外膜的周间质。 进行分泌型表达时，要将一段原核或真核的信号肽序列连接在待表达基因的上游。 常用的信号肽有ompT、phoA、pelB等，在表达的蛋白进入细胞周间质时，信号肽被蛋白酶水解，产生游离的表达产物。 因此，分泌型表达可以保护外源蛋白不被细胞内的蛋白酶降解，增加表达产物的稳定性，同时，表达蛋白的生物活性较好，易于纯化，但是，表达量往往比较低。 2.乳糖操纵子的调节机制 操纵子是原核细胞基因表达的协调单位。通常由两个以上功能相关的结构基因以及一些调节序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。乳糖操纵子由三个结构基因Z、Y、A和操纵序列、启动子、CAP结合位点等调节序列组成（如图1）。 （1）乳糖操纵子的诱导表达 当没有乳糖存在时，调节基因lacI表达，转录的mRNA翻译成阻遏蛋白。阻遏蛋白与操纵序列lacO结合，阻碍了结合在旁边启动子的RNA聚合酶向前移动，使目的基因（本实验中目的基因为非特异性核酸酶基因）不能转录，也就不能翻译出目的蛋白。也就是说，当没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻碍状态（如图2）。 （1）乳糖操纵子的诱导表达 当有乳糖存在时，乳糖转化为异乳糖，异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的构象发生改变，而不能结合到操纵序列上，RNA聚合酶可以从启动子向3′端移动，于是，结构基因可以转录出mRNA，然后翻译出蛋白质。也就是说，当有乳糖存在时，乳糖操纵子被诱导（如图3）。 【试剂与器材】 （一）试剂 1.LB 液体培养基???????? 每小组50ml2.10mg/mL卡那霉素溶液???? 10mL（全班共用）3.100 mmol/L IPTG溶液?????? 10mL（全班共用）  （二）器材超净工作台、恒温振