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Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程 未来的中国科学家们 ，加油！ Genloci Classic CRISPR-Cas9 内 部操作流程 Protocol No. PT140726-1 Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程 1，CRISPR-Cas9 基因编辑实验流程图如下： ～20bp - -3’ 5’ CACCG - CAAA -5’ 1 3’ 设计2 条单链oligo 序列；退 火形成双链DNA 。 U6 2 pGK1.1 将双链DNA 连接到载体中。 3 转化G10 Competent Cell；筛 选阳性克隆；测序验证序列； 质粒大提；电转染靶细胞。 4 在细胞内 crRNA 识别靶位点， Cas9 对靶位点进行随机剪切。 5 CruiserTM 酶切细胞池，计算突变 率；CruiserTM 酶切初筛阳性克隆； 将阳性克隆测序验证；做敲除序列 比对分析。 Protocol No. PT140726-1 Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程 2，操作步骤 实验前，请您务必做好以下验证实验： A ．单细胞生长情况，确保单个细胞可以正常生长形成单克隆，即，低密度的细胞在培养皿中可 以形成单克隆。 B．目的基因的表达情况分析，为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失，首先需要PCR 扩增 靶基因，并对PCR 结果进行测序，确保靶基因的完整存在；其次，您还可以用RT-PCR 分 析靶基因的活跃度。 1. 设计Oligo DNA 序列 首先，您需要在靶标DNA 区域中设计一对20bp 左右的oligo DNA，您可以通过以下在线工具设计： ●麻省理工学院的CRISPR Design：/ ●德国癌症研究中心的E-Crisp：/E-CRISP/designcrispr 下面我们选择麻省理工学院的CRISPR Design 工具来做设计举例，以Fut8 基因为例，一次只能输入 大小为23～250bp 的基因片段，最好一次只输入一个外显子，避免Guide 序列跨内含子的。 点击 “Download as genbank ”按钮，出现以下界面： “Fut8” 根据左边的score 的高低选取合适的Guide 序列，以Guide#1 序列为例，2 条单链oligo 的序列如下 （红色字体部分是要与BbsI 酶切后的载体相互补的部分）： Fut8-F: caccGAATGAGCATAATCCAACGCC Fut8-R: aaacGGCGTTGGATTATGCTCATTC ※注意：oligo DNA 设计序列的第一个碱基必须是G，如果你选取的Guide 序列的第一个碱基不是G，可自行加一个G 上 去。 另外，需在位点上下游各设计一条引物，用于后续 PCR 或测序检测阳性克隆，引物能扩增约 300bp 的DNA 片段，上游引物距突变位点约100bp，下