微生物基因工程第六章-3）课件.ppt

第六章 外源基因的表达（三） 8 外源基因表达产物的分离纯化 A 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 B 离子交换层析 C 凝胶层析 D 亲和层析 E 膜分离 F 原核生物表达的重组蛋白质量检测 A 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 针对不同的产物表达形式采取不同的策略 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 多种分离纯化技术的联合运用 合适分离纯化介质的选择 分离纯化过程的规模化 针对不同的产物表达形式采取不同的策略 采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度 低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行 浓缩处理； 采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体； 采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性 的，拟首先选用亲和层析进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应 用低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放 重组蛋白。 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 等电点处于极端区域（pI≤5 或pI≥8）的重组蛋白应首选 离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白； 重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合 层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离 常数应在合适的范围内（10-8-10-4 mol/L）； 疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的； 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的； 径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的 一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越 性。 多种分离纯化技术的联合运用 在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则： 应选择不同分离纯化机理的方法联合使用 应首先选择能除去含量最多杂质的方法 应尽量选择高效的分离方法 应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段 合适分离纯化介质的选择 常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Seperose。理想的分离纯化介质应具有下列性质： 对目标蛋白具有较高的分离效率 对目标蛋白不会造成变性 化学性能和机械性能稳定，重复性好 价格低廉 分离纯化过程的规模化 蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法 在大规模产业化过程未必合适，如： 实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁） 实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心） 因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于 生产工艺。 B 离子交换层析 离子交换层析的基本原理 离子交换介质的基本性质 离子交换层析的基本操作 离子交换介质的选择原则 离子交换层析的基本原理 离子交换层析是以离子交换剂为固定相， 以特定的含离子溶液为流动相，利用离子交换 剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混 合物中不同离子进行分离的层析技术。 离子交换介质的基本性质 离子交换剂的基本性能 离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化 合物如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等； 离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其 它阳离子或阴离子起交换作用 如果有两种以上的成分被吸附在离子交换剂上，则在用洗脱 液洗脱时，各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的平衡常数 吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变ppH使吸附的蛋白 质失去电荷而解离下来 不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和 力大小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中 的成分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的 离子交换介质的基本性质 离子交换剂的分类 阳离子交换剂：强酸型和弱酸型 可电离的基团 磺酸基（-SO3H） 磷酸基（-PO3H2） 羧酸基（-COOH） 酚羟基（-OH） 阴离子交换剂：强碱型和弱碱型离 可电离的基团 伯胺基（-NH2） 仲胺基（-NHCH3） 叔胺基（-N(CH3)2 季胺基（-N+(CH3)3 离子交换介质的基本性质 离子交换剂的分类 强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽 弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换