9）RT-PCR实验流程.doc

RT-PCR实验流程 准备：1. 8：00配DEPC水(100ml水中加0.1ml DEPC原液，混匀过夜，在磁力搅拌器上搅12h。注意：DEPC水剧毒，配完后所有用过的器皿均要高压灭菌)，12h后，用DEPC水浸泡EP管、枪头、RT管。其余约100ml DEPC（高压灭菌15min，121℃使其失活）。同时，取几个烧杯、Dounce(邓氏)匀浆器、解剖器(两套剪、镊) （180℃烤8小时，用锡箔纸包裹）。 2. 取出EP管、枪头 、RT管，枪头盒内，同时PCR管放于小盒内（高压灭菌15min，121℃），然后放于烘箱内烘干，60-80℃，4h， RNA的提取 1. 药品：Trizol Reagent、氯仿、异丙醇、75%乙醇(DEPC水配制)、DEPC水、逆转录试剂盒。 仪器：(要用180℃烤8小时，用锡箔纸包裹)几个烧杯、Dounce(邓氏)匀浆器、解剖器(两套剪、镊)，玻璃瓶(放DEPC水用)、枪头和EP管(DEPC泡12小时、高压)，枪、RT管及PCR管。PCR仪，电泳仪，分光光度计。 注意：因为RNA很容易被RNA酶降解和被污染，所以实验中一定要注意使用一次性口罩和手套，不要在提取过程中说话。 2．取材 实验动物在取材前一天禁食以降低肝糖元； 用75%酒精擦实验台； (3)备好DEPC处理的EP管，做好标记，各EP管称重、记录； (4)取材50-100mg，用DEPC水冲干净或用生理盐水冲洗一下，用滤纸吸干水分，锡箔纸包裹，迅速放入液氮中。或直接放入EP管，所用手术器械均用DEPC水冲洗。 3．Trizol Reagent 提RNA (1)50-100mg组织中加1ml Trizol Reagent，EP管中剪碎组织(可先加800μl Trizol，匀浆后再加200μl洗匀浆器)； (2)匀浆器匀浆(轻轻，避免起沫)，如果起沫可瞬时离心，500rpm； (3)相分离：15-30℃放置样品5min使核蛋白复合物彻底分离，每1ml Trizol Reagent0.2ml氯仿上下快速颠倒摇动15秒，静置15-30℃孵育2-3min，（提前降温）4℃ 12000g 离心15min； (4)RNA沉淀：将上清转至一新EP管(需保留DNA或蛋白则留沉淀)。每1mlTri 中加0.5ml异丙醇沉淀RNA，15秒，静置15-30℃ 10min，4℃12000g 10min；(5)倒出上清（离心后用5μl枪头吸干残液）再离心再吸，用0.5ml 75%乙醇（DEPC水配）弹起沉淀(在涡旋振荡器上)洗涤RNA沉淀1次，4℃11000g 离心5min； (6)重溶解RNA：吸出乙醇，瞬时离心两次，5μl10min，即半透明，如果全干很难再溶），用30μl Nuclease free water,RNA，55-60℃水浴孵育10min（帮助溶解）； (7)测浓度及纯度：取0.8μl溶解的RNA，稀释到200μl (用去离子水即可)（先测BLANK即去离子水，再测RNA），测RNA浓度及纯度(Eppendorf)分光光度计法(RNA(μg/μl)=(OD260-OD32) 10)，（因1OD260=40μg/mlRNA，所以200/0.8 ×40/1000=10）。OD260 /OD2801.7-2.0之间，则所提RNA质量很好，很纯，若小于上述值，则需要重复实验去掉蛋白。提出的RNA若马上用放于4 -70℃。 (RT)Promega公司 Reverse Transcription System . 42℃反应1h， 9℃ 5min终止逆转录 4℃保存(-20℃可长期保存)。 PCR仪：CNTRL TUBE LID=105℃ WAIT FIX 1 T=42.0℃ 1：00：00 2 T=9℃ 00：05：00 3 HOLD 4℃ ENTER PCR RT完了反应体系中再加80μl 去离子水，稀释成为100μl。 PCR反应液(同样先加水最后加Taq) 总20μl即可 3.7 μl PCR Buffer 2μl dNTP Mixture 1.6μl 引物1与 引物2 μl Taq 聚合酶 0.μl（不要拿出冰箱） Taq酶后放于冰上，最后加 模板cDNA μl 水7ul (2)PCR反应条件(TfR2的) 94℃ 30秒，56℃ 40秒，72℃ 60秒，32个循环，4℃保存过夜。 (TfR2Primer