第二章_基因工程工具酶课件.pptVIP

同裂酶(isoschizomer) 1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种 或多种限制 酶 2. 特点：1）识别相同顺序 2）切割位点的异同 KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstII CCGC GG SacII CCGC GG SmaI CCC GGG XmaI C CCGGG 同 尾 酶 如：BamHI G GATCC BglII A GATCT MboI, Sau3AI N GATCN 上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组分子能被MboI和Sau3AI识别和酶切，但BamHI和BglII的识别机率只有1/16。 BamHI + MboI A/C/G/T GATCT/C/G/A BamHI和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。 BamHI + BglII A/G GATCT/C 2、制备细菌DNA时，应注意DNA在原细胞中的被修饰，选用无限制系统细菌(E.coli)或选用甲基化不敏感的同裂酶。 用 途 1） 除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时） 2） 补齐5’-突起端 3） 合成第二条cDNA 4） 切口移位制备探针 其中用途2) 和3)常用大片段 2. klenow(E.coli) 练 习 题 1. 一种DNA分子经三种限制酶完全酶切后得如下结果： EcoRI 5kb EcoRI/HindIII 1、2、3、4kb HindIII 3kb 、7kb EcoRI/PstI 2、3、5kb PstI 10kb HindIII/PstI 1、3、6kb 将各限制酶位点绘制在DNA分子上。 ? 2.?另一DNA分子经相同处理后得如下结果，将各限制酶位点标在DNA分子上。 EcoRI 1、3、6kb EcoRI/HindIII 1、3kb HindIII 4、6kb EcoRI/PstI 1、3、5kb PstI 2、8kb HindIII/PstI 2、6kb ? 来源：E.coli DNA PolymeraseⅠ经蛋白酶水解的大片段(Klenow和Henningseon.1970) DNApolymerasel 枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶 C 端 76，000 d Klenow活性 ５′→ ３′聚合 ３′→ 5′外切 ＋ N 端 36，000 5′→３′外切 Jacobsen(1974),Joyce 和 Grindley,(1983)克隆此大片段。 用途： ①填补限制酶的5′-粘性末端为平齐末端： ５′… C C ３′… G G A A T T Klenow ５′… C C T T A A ３′ ３′ … G G A A T T ５′ ②末端标记 a. 平齐末端中用（α-32p) dNTP , 底物可标记 ３′末端 b. 对于３′粘性末端 ５′ A A G G C C T T A A ３′ ３′ T T C C G G ５′ 外切 ３′— ５′外切 无底物时 Klenow ５′… A A ３′ ３′ … TT C C G G ５′ 4 种Dnap + α- 32p dNTP Klenow ５′… A A G G C C ３′ ３′ … T T C C G G ５′ Klenow 在无底物时只进行３′— ５′外切；有底物存在时则聚合。 以上也称作交换标记，但此作用不如T4DNA聚合酶。 ③在cDNA克隆中合成cDNA第二链。 RNA 逆转录 RNA cDNA Rnase H SS cDNA Klenow ds cDNA ④DNA测序—末端终止法(Sanger 1977) ⑤通过3′→5′外切，平齐限制酶切产生的3′粘性末端(现在多用T４DNA polymersase) ⑥最早用于PCR聚合反应，现已用Taq酶取代