生物制药层析技术范例.ppt

* 常用的商品化凝胶介质 * 一 五、 凝胶层析的生产条件和操作 * * 凝胶层析的生产条件和操作 （一）、凝胶的选择 （二）、凝胶层析柱的设计 （三）、凝胶层析柱的填装 （四）、凝胶床的检查和维护 （五）、凝胶层析操作 * （一）凝胶的选择 一、凝胶的选择 选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）还有它的理化稳定性、强度、非特异吸附性质等；另一方面还要注意到分离目的和样品的性质。 凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。—般来说，细粒凝胶柱流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐等。下图表示在同一流速下不同粒度的Sephadex G-25柱的洗脱效果。 凝胶粒度与洗脱效果的关系图 对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。另一类则是要将分子量相差不很大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。后者对实验条件和操作要求都比较高。下面以最常用的葡聚糖凝胶类为例，分别加以讨论 。 * 将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。 将分子量相差不大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。 1．类分离 目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子组”和“较小分子组”两类物质，并不要求分离分子量相近的组分。 选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd= 0，小分子的Kd＝1。这样能取得最好的分离效果。 例如从蛋白质溶液中除去无机盐。我们知道，蛋白质的分子量都大于5000D，而无机盐的分子量一般在几十到几百之间。所以常选用Sephadex G-25凝胶作为分离固定相，因为它的分离范围是1000～5000D。被分离的两组物质的分子量正好落在分离范围的两侧。大分子组为全排阻，而小分子组为全渗入，其Kd值的差可达最大值1。对于分子量小于5000D的肽类进行脱盐操作则常选用Sephadex G-15凝胶。 * （1）使大分子的分配系数Kd=0； （2）小分子的Kd=1。 选用Sephadex G-25凝胶，分离范围1 000～5 000。 2．分级分离 目的是分开分子量不很悬殊的大分子物质。选择凝胶型号时必须使各种物质的Kd值尽可能相差大一些。为此，首先决不能使它们的分子量都分布在凝胶分离范围的一侧，也就是Kd不要都接近于0或1，而要使组分的分子量尽可能分布在凝胶分离范围的两侧，或接近两侧的位置。如果样品中含有3个组分的话，最好一个接近全排阻，另一个接近全渗入，第三个为部分渗入，且分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的1／3。 * Sephadex G 编号意义： 1、吸液量； 2、溶涨时间； 3、凝胶孔径； 4、分离范围 蛋白质、多糖 * 葡聚糖凝胶性能与编号的关系 编号 交联度 吸液量 膨胀速度 凝胶孔径 分离限 凝胶强度 大 （ Sephadex G－150 ） 小 大 慢 大 大 小 小 （ Sephadex G－ 50 ） 大 小 快 小 小 大 * 葡聚糖凝胶（G类）的规格 * 葡聚糖凝胶（G类）特点 1、孔径。 2、稳定性。 3、吸附作用。 4、芳香族化合物和杂环化合物。 1、Sephadex在水、盐、碱、弱酸以及有机溶液中都比较稳定，可以多次重复使用。 2、稳定工作pH为2－10，强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂。 3、在高温下稳定，可煮沸消毒，在100 °C下40 min对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。 性质与特点 4、含有羟基，呈弱酸性，有可能与分离物中的一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎没有吸附作用。 5、有各种颗粒大小（粗、中、细、超细）可以选择，一般粗颗粒流速快，但分辨率较差；细颗粒流速慢，但分辨率高。 6、机械稳定性相对较差，不耐压，分辨率高的细颗粒要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。 * 保存 保存的方法有干法、湿法和半缩法三种。 湿法：加入一定量的防腐剂置于冰箱中作短期保存（6个月以内）。 常用0.02%叠氮化钠、0.02%三氯叔丁醇、20%乙醇等。 干法：用浓度逐渐升高的乙醇分