六、α-淀粉酶酶学性质测定II改课件.pptVIP

六、α-淀粉酶酶学性质测定II（米氏常数Km值的测定) 1.目的意义 由Leonor Michaelis和Maud Menten在1913年提出的米氏方程（Michaelis-Menten Equation）是酶学中表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的、表示一个酶促反应的起始速度V与底物浓度[S]关系的方程。 米氏方程形式如下所示： 其中，Vmax表示酶被底物饱和时的反应速度，Km值称为米氏常数，是酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度,即V = 1/2Vmax时, Km = [S] 。 在酶促反应中，底物在低浓度情况下，反应相对于底物是一级反应（first order reaction）；而当底物浓度处于中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应（mixed order reaction）；当底物浓度增加时，反应由一级反应向零级反应（zero order reaction）过渡；当底物浓度[S]逐渐增大时，速度V相对于[S]的曲线为一双曲线。下图为米氏方程的模拟作图： 米氏常数的意义 由米氏方程可知，当反应速度等于最大反应速度一半时,即V = 1/2Vmax时, Km = [S] 。 上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。 因此,米氏常数的单位为mol/L(在本实验中单位为g/L)。 不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。 Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。 Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。 通过Km值的测定，可鉴定酶的各种底物，Km值最小者为酶最佳底物，即天然底物。 2.实验原理 底物浓度对酶促反应的影响 在酶浓度、pH、温度等条件不变的情况下研究底物浓度和反应速度的关系。如右图所示： 在低底物浓度时, 反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。 当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。 酶促反应中的米氏常数的测定和Vmax的测定有多种方法。比如固定反应中的酶浓度，然后测试几种不同底物浓度下的起始速度，即可获得Km和Vmax值。但直接从起始速度对底物浓度的图中确定Km或Vmax值是很困难的，因为曲线接近Vmax时是个渐进过程。因此，通常情况下，我们都是通过米氏方程的双倒数形式来测定，即Lineweaver-Burk plot，也可称为双倒数方程(double-reciprocal plot)： 用1/V 对1/[S]作图，即可得到一条直线，该直线在Y轴的截距即为1/Vmax，在X轴上的截距即为1/Km的绝对值，斜率为Km/Vmax。如图所示： 3.仪器设备 3.1 试剂 10mg/ml 可溶性淀粉 1500ml 0.005% 碘液 2000ml 0.25M 醋酸溶液 0.4M pH6.0醋酸缓冲液 3.2 器材 15ml 大试管20支 1ml 移液管2支 5ml 移液管2支 10ml 移液管2支 200ml 烧杯2个 100ml 烧杯2个 玻棒 1支 双蒸水1瓶（50ml） 比色皿1套（4个）、玻璃皿1套、洗瓶1个 吸耳球 1个 记号笔1支 试管架2个200μl-1000μl、20μl-200μl、0.5μl-10μl移液器各1支； 小号、中号、大号枪头各1盒（需灭菌） 旋涡混合器1套（置于每组桌上） 4.实验方法 取一定量的酶（稀释为10-6倍）； 加入各种不同浓度的底物（如表所示）； 在一定时间内测定产物的量（30min）； 建立x，y轴，作图，建立回归方程； 在Y=0时，求其x值（即[S]）→Km； 4.1 测定—取12支试管，分别标记，按照下表操作。 注意：每组（不同底物浓度）都需要设置D0为对照，计算出U值。 chenhuicheng@ynu.edu.cn 4.2 数据处理 各管在700nm测定OD700nm值（注意，比色皿务必洗净擦干）。 由于光密度（OD700nm）与显色，显色与底物浓度成正比，反应时间均为30min。计算1/V，以1/V为纵坐标作图。 由于测定所用单位为mg·mL-1换算为Km单位g·L-1 。 由1/V对1/[S]作图，求得回归方程，计算α-淀粉酶催化可溶性淀粉溶解的米氏常数Km（当y=0时，求x值）。 作图以1-5管数据来做。 * * Km=-1/x 1/A 1/[S]( mg·ml-1) A(OD700nm) 取1