白藜芦醇预处理对急性乙醇暴露的斑马鱼幼鱼行为的影响.docVIP

白藜芦醇预处理对急性乙醇暴露的斑马鱼幼鱼行为的影响 　　[摘要]目的 探讨不同光照条件下白藜芦醇预处理对不同浓度急性乙醇暴露的斑马鱼幼鱼行为的影响。方法 取成功脱模的第0天野生型AB品系斑马鱼鱼卵300颗，均分为两组，分别用系统水和白藜芦醇处理4 d。第5天时每组再分为4个小组（每个小组36颗），分别暴露在不同浓度的乙醇中（0.0%、0.5%、1.0%、2.0%），在光照和黑暗环境中，记录斑马鱼幼鱼每分钟的游动距离，并用双因素方差分析处理数据。结果 黑暗条件下，0.0%和0.5%乙醇作用的白藜芦醇处理组斑马鱼幼鱼游动距离显著减少。在对光线变化的应激反应中，0.5%乙醇作用下的白藜芦醇处理组光照期与黑暗期的游动距离比值显著增加；2.0%乙醇作用下白藜芦醇非处理组的光照期与黑暗期的游动距离比值1。结论 在斑马鱼幼鱼胚胎发育早期补充白藜芦醇对急性乙醇暴露所导致的自发游动行为异常有一定的改变作用。 　　[关键词]白藜芦醇；乙醇；自发运动；应激反应；行为 　　[中图分类号] R-332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）08（b）-0015-04 　　乙醇是一种水溶性以及脂溶性都非常好的极性小分子，对包括血-脑脊液屏障在内的各种生物膜都具有很强的穿透力，对神经系统的功能有显著影响。动物研究实验表明，乙醇对机体的运动能力、感觉能力乃至包括学习和记忆在内的高级认知功能都有损伤作用[1-4]。 　　斑马鱼是一种在发育生物学以及遗传学研究中被广泛应用的模式生物，近年来在神经药理学研究中的应用也逐渐增多。急性乙醇处理对斑马鱼的神经系统功能以及相关的行为学指标也有显著的影响[5-7]。 　　白藜芦醇是一种主要来源于花生、葡萄、蓝莓、虎杖等植物的天然多酚类化合物，有明显的生物活性，具有保护心血管系统、延缓衰老以及抗癌等功效，同时对于乙醇导致的肝脏以及神经系统损伤具有一定的缓解作用[8-10]。 　　本研究以新兴模式生物斑马鱼作为研究对象，探讨白藜芦醇处理对斑马鱼幼鱼在急性乙醇作用下自发运动、受激运动的影响。 　　1材料和方法 　　1.1动物 　　野生型AB型斑马鱼来源于复旦大学附属儿科医院转化中心，按照Westerfield所著的书[11]中的方法进行养殖和繁殖，室温和水温均为（28.5±0.5）℃，每日14 h光照，10 h黑暗循环（亮灯时间：8∶00，暗灯时间：22：00）。 　　1.2试剂 　　乙醇为优级纯，国药集团化学试剂；白藜芦醇购自Vetec公司；链霉蛋白酶购自罗氏公司。 　　1.3药物制备 　　1.3.1链霉蛋白酶制备 取1 g链霉蛋白酶，用22.2 ml的灭菌水溶解于50 ml离心管，密封试管，置于37℃水浴45 min，轻柔震荡，制得浓度为45 mg/ml的链霉蛋白酶，分装置于超低温冰箱保存备用。 　　1.3.2乙醇溶液制备 分别量取乙醇0.2、0.4、0.8 ml，均使用系统水定容至20 ml，制得浓度（v/v%）为1.0%、2.0%、4.0%的乙醇溶液。 　　1.3.3白藜芦醇溶液制备 电子天平称取白藜芦醇粉末0.030 g，使用系统水定容至1 L，制得浓度为0.03 g/L的白藜芦醇溶液。 　　1.4仪器 　　电子天平：德国Sartorius公司；隔水式恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；Milli-Q超纯水系统：美国Millipore公司；体视显微镜：德国Zeiss公司；斑马鱼行为学分析系统：法国ViewPoint公司；细胞培养TC24孔板（每孔半径r=8 mm）：上海吉泰远成生物科技有限公司。 　　1.5白藜芦醇预处理 　　取自然繁殖的0 dPF鱼卵若干颗，用链霉蛋白酶进行脱膜处理。取成功脱模且状态良好的鱼卵300颗并均分为两组，即白藜芦醇处理组和白藜芦醇非处理组。白藜芦醇处理组鱼卵使用0.03 g/L的白藜芦醇溶液从0 dPF养殖到4 dPF，再将0.03 g/L的白藜芦醇溶液换成系统水，养殖至5 dPF。白藜芦醇非处理组鱼卵使用系统水从0 dPF养殖到5 dPF。 　　1.6行为学检测 　　将幼鱼转移至24孔板中，每孔1条幼鱼。向孔中加入1 ml不同浓度的乙醇溶液（0.0%、0.5%、1.0%、2.0%）。将24孔板放入行为学分析系统箱体中。 　　1.7开放旷场实验 　　斑马鱼幼鱼可以在每个孔中自由游动，由箱体内摄像机记录每个孔中斑马鱼幼鱼的游动轨迹。实验周期设置为40 min，分别是1～25 min处于光照适应期（正常环境）、26～30 min处于光照测试期（正常环境）、31～35 min处于黑暗期、36～40 min光照恢复（正常环境）。光照期：光照强度为100 Lux；黑暗期：光照强度为0 Lux。白藜芦醇处理组和白藜芦醇非处