生化分析技术三电泳.ppt.docx

第三节 电泳技术Electrophoresis 技术起源 1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法(Moving boundary electrophoresis)，并于1948年荣获诺贝尔奖。70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标： 1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。 各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。 AWK Tiselius (1902—1971) 目录 1. 电泳技术的基本原理 2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 3. 醋酸纤维素薄膜电泳 4. 等电聚焦 5. SDS测定蛋白质分子量 6. 双向凝胶电泳 7. 高效毛细管电泳(HPCE) 8. 电泳技术相关延伸应用 1、掌握电泳技术的基本原理。 2、掌握SDS测定蛋白质分子量的原理和技术。 3、学习等电聚焦电泳、双向凝胶电泳、毛细管电泳原理及应用。 4、了解免疫印记技术等电泳相关延伸应用。 本节教学目的 1.电泳技术的基本原理 电泳：带电粒子在电场中的定向移动。 U: 电压 L: 电极之间的距离 E: 电场强度 F: 电场对带电分子作用力 F’: 溶液对带电分子粘滞力 η: 溶液黏度系数 1.电泳技术的基本原理 (1)、E = U/L (2)、F= q*E (3)、F’ = 6π*r*η*v = 6π*r*η*d/t (4)、F = F’ (5)、q*E = 6π*r*η*d/t (6)、m = v/E = q*v*t/(6π*r*η*d)=q/(6π*r*η) r: 带电分子半径 d: 带电分子移动距离 t: 带电分子移动时间 v: 带电分子泳动速度 m: 单位电场强度内带电分子迁移速度 (7)、mA/mB = k(qA/qB)*(rB/rA) 1.电泳技术的基本原理 小结：影响泳动率u的因素 内因： 1.净电荷 2.质点大小 3.质点形状 外因： 1.E ( U/L) 2.缓冲液的pH (pH恒定) 3.离子强度[I] 最适:0.02-0.2 4.电渗：液体对固体支持物的相对移动 电泳类型 ⑴区带电泳 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。 凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳包括：垂直板、盘状、等电聚焦、梯度、免疫电泳 ⑵自由界面电泳 支持物为溶液，很少用。 1.电泳技术的基本原理 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide,简称Bis)在加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetram-ethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O3，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2,C17H2O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。 光聚合：核黄素为催化剂(阳光,日光)，制大孔胶。 化学聚合：制小孔胶。 引发剂：过硫酸铵(NH4)2S2O3 APS 加速剂：N,N,N’,N’-四甲基乙二胺 TEMED 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 丙烯酰胺 反应方程式： 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 N, N’-甲叉 （亚甲基） 双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺 三种物理效应 ⑴样品浓缩效应 ⑵分子筛效应 ⑶电荷效应 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 样品浓缩效应：由凝胶系统的不连续性产生。 ①凝胶孔径不连续性 ②缓冲液离子成份的不连续性 ③pH的不连续性 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 ①凝胶孔径不连续性 单体浓度 交联度 大孔胶:T=3% C=2.0% 小孔胶:T=7% C=2.5% 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 ①凝胶孔径不连续性 凝胶网孔大小: 聚合链长度:由Acr浓度决定 交联程度:由Acr与Bi