DNA指纹谱与HPLC指纹谱对中药降香质量评价研究.pdf

DNA指纹谱与HPLC指纹谱对中药降香质量评价研究 沙明 訾慧 孟宪生 曹爱民 辽宁中医学院中药系 辽宁 沈阳 110032 摘要 目的 对全面评价中药降香内在质量的方法进行研究 以使降香药材质量进一步规范化 方法 采用分子生物学技术随机扩增多态性DNARAPD技术对降香及其易混淆品山油柑进行分析 采用试 剂盒法提取模板DNA然后将RAPD 扩增产物在1.5%琼脂糖上电泳 检测PCR 结果 以 DNA/ Hind + EcoR 酶切产物作为 DNA 分子量标准 在紫外灯下观察谱带情况 并照相 同时采用HPLC 指纹谱法对全国不同地区商品降香的黄酮类成分进行指纹图谱研究 色谱条件 色谱柱:Shim-pack CLC-ODS柱 6.0mm150mm5 m 流动相:甲醇-乙腈-0.025mol/l磷酸 202555 检测波长: 368nm流速: 1.0ml/min柱温: 40记录仪纸速: 0.3cm/min结果 能够提供清晰RAPD指纹 谱 使正品降香与其易混淆品山油柑得到了很好的鉴别 该方法可靠 准确 快速 重现性好 达到 了分子生物学上鉴定正品降香与易混淆品山油柑的目的 提供了全国不同地区商品降香的黄酮类成分 HPLC指纹谱 得到了6个共有峰 结论: 两种方法能够对降香及其混淆品进行全面质量评价研究 为进一步规范中药降香的质量提供了实验依据 关键词 RAPDPCR高效液相色谱法 指纹图谱 降香 降香始载于 海药本草 正名为 降真香 以其气颇馥郁 焚之能降诸真 故名 又名 紫 藤香 卫济宝书 降真 真腊风土记 降香 本草纲目 本品入药 始于唐代 海药本草 载本品温平 主天行时气 明 本草纲目 言其能 疗折伤金疮 止血定痛 消肿生肌 本草经 疏 则指出本品能 治内伤或怒缺气伤肝吐血 清 本草逢原 概括本品的特点为 入血分而下 降 故内服能行血破滞 外服可止血定痛 至此 历代医家对本品认识已渐趋全面 现代医家对本 品临床应用 药理等方面研究更为深入 中华人民共和国药典 2000年版 记载本品降香为豆科植物降香檀 树干和根的干燥心材 具有行气止痛 活血止血之功效 用于心胸闷痛 脘胁刺痛 外治跌扑出血 [1] [2] 其主要化学成分为挥发油类及黄酮类 其中黄酮类化合物总含量为2.55.8%其药材的来源除降 香檀之外 在民间作为降香用的还有海南黄檀 进口印度黄檀 印度紫檀及芸香科植物山油柑等[3] 其中引起广泛争议的是山油柑能否作为降香使用[45] 此外 既使是相同的降香檀品种 不同产地 不同来源的药材质量也有很大差异 这影响到中医临床用药及中药产品质量控制的稳定性 而药典只 以测定降香醇提取物的方法进行质量控制 这不能全面反映降香的内在质量 为此 完善和提高降香 药材质量标准 使之达到科学化 标准化 本文从分子生物学RAPD分子标记技术及HPLC指纹谱方面 进行了研究 为全面控制中药降香的质量提供了科学的依据 1 降香及其混淆品RAPD技术鉴别研究 RAPD技术鉴别中药材的品种已经有了非常广泛的应用[67] 鉴于RAPD技术的优点和特点 拟用 RAPD技术来鉴别中药降香及其易混淆品山油柑 本实验以BBI公司出品的试剂盒提取的中药的总DNA 作为模板 以上海生工生物工程有限公司出品的40种随机引物进行RAPD扩增 得到它们的RAPD指 纹图谱 结果表明 降香及其混淆品山油柑之间确实存在着多态性差异 用RAPD技术使它们得到了 很好的鉴别 1.1材料 试剂及仪器 实验药材 正品豆科植物降香檀 购自全国不同的省份 易混淆品芸香科植物山油柑 本院植物 教研室提供 以上均由辽宁中医学院中药系鉴定教研室王荣祥老师鉴定 试剂 SDS提取缓冲液 HCl(PH8.0) B ME CTAB提取缓冲液 2% CTAB, 50mM Tris Uniq植物DNA提取试剂盒购自BBI公司 Taq DNA聚合酶 bufferdNTPsRAPD随机引物 EB(溴 化乙啶) 购自上海生工生物工程有限公司 其余试剂均为国产分析纯 仪器 PCR仪 PTC 电泳仪 DYYIII 8B型 北京六一仪器厂 紫外可见分光光度计 UV755B,上海分析仪器总厂 台式高速离心机 TGL_16G,上海医用分析仪