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第一章 基因工程 第一节 基因工程概述 一．基因工程的概念 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 结果 生物体外 基因 分子水平 剪切→拼接→导入→表达 人类需要的基因产物由于基因工程是在水平上进行,因此又叫做。 1．来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 2．功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两 个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 3．结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 （二）“分子针线”——DNA连接酶 1．分类：根据酶的来源不同，可分为EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键 ②区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接； T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。 ★DNA连接酶与DNA聚合酶作用的比较 DNA连接酶DNA聚合酶DNA 双链 单链 模板 不要模板 要模板 连接的对象 2个DNA片段 单个脱氧核苷酸加到已存在的单链DNA片段上 相同点 作用实质 形成磷酸二酯键 化学本质 蛋白质 (三) “分子运输车”——载体 1.载体具备的条件： 2.基因工程的载体有： 和 动、植物病毒 等。 最早应用的载体是质粒，它是细菌细胞中的一种很小的双链环状DNA分子。 三．基因工程的基本过程 (一) 获得目的基因（目的基因的获取） 1.获取方法主要有两种：①从自然界中已有的物种中分离出来，如可从基因文库中获取。 ②用人工的方法合成。 ★获得原核细胞的目的基因可采取直接分离，获取真核细胞的目的基因一般是人工合成。 ★人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。 2.利用PCR （1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。 （2）目的：获取大量的目的基因 （3）原理：DNA双链复制 （4）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链为单链； 第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合； 第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。 （5）特点：指数形式扩增 (二) 制备重组DNA分子（基因载体1．重组DNA分子的组成：除了目的基因外，还必须有标记基因。 ★标记基因的作用：鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 2．方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。 (三) 转化受体细胞（将目的基因导入受体细胞） 1.转化的概念：常用的转化方法： 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法 ②将目的基因导入动物细胞：最常用的方法 ③将目的基因导入微生物细胞： (四) 筛选出获得目的基因的受体细胞、培养受体细胞并诱导目的基因的表达（目的基因的检测与鉴定） 1.首先要检测 2.其次还要检测 3.最后检测 4.有时还需进行 （2）动物基因工程：提高动物生长速度来提高产品产量、改善产品品质，用转基因动物生产药物，用转基因动物作器官移植的供体等。 （3）基因诊断和基因治疗： 基因诊断：又称为DNA诊断，是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。 基因治疗：指利用正常基因置换或弥补缺陷基因的治疗方法。 实例：ADA基因缺陷症的基因治疗 第三节 蛋白质工程 1．蛋白质工程的实质：根据蛋白质的结构与功能之间的关系，，定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的、具有优良特性的蛋白质。蛋白质，定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的 （2）与植物组织培养的关系 ①植物组织培养是基础。 ②目的不同：植物组织培养的目的是得到更多的植物体，植物细胞培养的目 的是获得人类所需的细胞 （3）实例：成功地培养红豆杉的细胞，从中提取出重要的抗肿瘤药物——紫杉醇。 4.植物体细胞杂交技术 （1）过程： （2）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。 （3）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。 （二）动物细胞工程 1. 动物细胞培养 （1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。 （2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。 （3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁 核移植 胚胎移植